Heterogeneity and subtype acquisition in the zebrafish enteric nervous system

Abstract

The enteric nervous system (ENS) comprises gut-intrinsic neurons and glia that regulate peristalsis, nutrient uptake, and water absorption. Unlike mammals, adult zebrafish enteric glial cells (EGCs) retain proliferative potential and can generate neurons during homeostasis. This project investigates the neurogenic journey of EGCs and mechanisms driving neuronal subtype specification. Using in situ hybridization and single-nuclei RNA sequencing (snRNA-seq) to characterize transcriptional signatures in adult enteric glia and neurons, we identified novel glial markers that uniformly label the EGC population (e.g. scn4ab) and markers specific to EGC subpopulations (e.g., foxd3 and id1). We discovered a glial cluster expressing the proneural marker ascl1a, which is prominent during development and following Notch inhibition, suggesting that it identifies ENS neuronal progenitors. We also characterized the genetrap line Gt(foxd3-mCherry), which labels a broader EGC population than the already described EGC-labelling tools and marks some cells expressing ascl1a, thus serving as a reliable tool to label EGCs and some neuronal progenitors. Tracking newly born neurons in juveniles and adults via EdU experiments, we showed that all major neuronal subtypes are generated, although their proportions vary with age. Our data also identified four transcription factors - etv1, ebf1a, gata3, and bnc2 - that we showed to define nitrergic (etv1, ebf1a), cholinergic (etv1, gata3) and serotonergic (bnc2) neuronal subtypes and to be expressed early in development. In larvae, we detect ENS neurons expressing etv1 that co-express mature markers of all three lineages, including the serotonergic marker tph1b, suggesting a broader role for etv1 in neuronal subtype commitment. Gene knockout experiments revealed that etv1 deletion in larvae reduces total and nitrergic neuronal numbers, while bnc2 deletion decreases serotonergic neurons in juveniles. These findings highlight the essential roles of these transcription factors in neuronal subtype specification. Further studies are needed to determine their broader impact on other neuronal subtypes and across different developmental stages.

Το εντερικό νευρικό σύστημα (ENΣ) αποτελείται από νευρώνες και γλοία του εντέρου, τα οποία ρυθμίζουν την περισταλτικότητα, την πρόσληψη θρεπτικών συστατικών και την απορρόφηση νερού. Σε αντίθεση με τα θηλαστικά, τα εντερικά γλοιοκύτταρα (EGCs) του ενήλικου ζεβρόψαρου διατηρούν πολλαπλασιαστική ικανότητα και μπορούν να παράγουν νευρώνες κατά τη διάρκεια της ομοιόστασης. Το έργο αυτό διερευνά τη νευρογενετική πορεία των EGCs και τους μηχανισμούς που διέπουν τον καθορισμό των νευρωνικών υποτύπων στο ΕΝΣ. Χρησιμοποιώντας υβριδοποίηση in situ και αλληλούχηση RNA (single-nuclei RNA sequencing, snRNA-seq) για τον χαρακτηρισμό του μεταγραφικού προφίλ EGCs και νευρώνων από ενήλικα zebraifsh, εντοπίσαμε νέους δείκτες γλοιοκυττάρων που εκφράζονται ομοιόμορφα στον πληθυσμό των EGCs (π.χ. scn4ab), καθώς και δείκτες ειδικούς για υποπληθυσμούς EGCs (π.χ. foxd3 και id1). Ανακαλύψαμε επίσης έναν πληθυσμό γλοιοκυττάρων που εκφράζει τον προ-νευρωνικό (proneural) δείκτη ascl1a, ο οποίος εκφράζεται ιδιαίτερα από προνευρικά κύτταρα κατά την ανάπτυξη και μετά από αναστολή της σηματοδότησης Notch, υποδηλώνοντας ότι τα κύτταρα αυτά αντιστοιχούν σε νευρωνικούς προγόνους του ENΣ. Επιπλέον, χαρακτηρίσαμε τη διαγονιδιακή γραμμή - genetrap line Gt(foxd3-mCherry), η οποία εκφράζεται από τον ευρύτερο πληθυσμό EGCs σε σύγκριση με τα ήδη διαθέσιμα εργαλεία και από ορισμένα κύτταρα που εκφράζουν τον παράγοντα ascl1a, αποτελώντας έτσι ένα αξιόπιστο εργαλείο για τη σήμανση των EGCs και ορισμένων νευρωνικών προγόνων. Παρακολουθώντας νέους νευρώνες σε νεαρά και ενήλικα zebrafish μέσω πειραμάτων EdU (5-Ethynyl-2′-deoxyuridine), δείξαμε ότι όλοι οι κύριοι νευρωνικοί υπότυποι παράγονται κατά την διάρκεια της ζωής του zebrafish, αν και οι αναλογίες τους μεταβάλλονται με την ηλικία. Τα δεδομένα μας ανέδειξαν επίσης τέσσερις μεταγραφικούς παράγοντες - etv1, ebf1a, gata3 και bnc2 - οι οποίοι καθορίζουν νευρώνες που παράγουν το μονοξείδιο του αζώτου (nitrergic neurons) (etv1, ebf1a), χολινεργικούς (cholinergic neurons) (etv1, gata3) και σεροτονινεργικούς (serotonergic neurons) (bnc2) νευρωνικούς υποτύπους και εκφράζονται πρώιμα κατά την ανάπτυξη. Σε zebrafish προνύμφες, ανιχνεύσαμε νευρώνες του ENΣ που εκφράζουν etv1 και συν-εκφράζουν ώριμους δείκτες και των τριών υποτύπων, συμπεριλαμβανομένου του σεροτονινεργικού δείκτη tph1b, γεγονός που υποδηλώνει έναν ευρύτερο ρόλο του etv1 στη νευρογένεση. Πειράματα γονιδιακής απενεργοποίησης έδειξαν ότι η απώλεια του etv1 σε zebrafish προνύμφες μειώνει τον συνολικό αριθμό νευρώνων και ειδικότερα των νευρώνων που παράγουν μονοξείδιο του αζώτου, ενώ η απενεργοποίηση του bnc2 μειώνει τους σεροτονινεργικούς νευρώνες σε νεαρά zebrafish. Τα ευρήματα αυτά αναδεικνύουν τον κρίσιμο ρόλο των συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων στον καθορισμό νευρωνικών υποτύπων. Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για τη διερεύνηση της ευρύτερης επίδρασής τους σε άλλους νευρωνικούς υποτύπους καθώς και σε διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια.