Structural studies of the IAPP membrane-mediated aggregation pathway

Abstract

Amyloid deposition in tissues is a common feature of several human diseases, including Parkinson’s disease, Huntington’s disease, and type II diabetes mellitus. In type II diabetes, amyloid deposition occurs in pancreatic β-cells and contains fibrillar islet amyloid polypeptide (IAPP) as a major component. In all amyloid diseases, a soluble protein undergoes misfolding and subsequently forms β-sheet-rich fibrillar aggregates. This aggregation process is multistep and nucleation-dependent, with several intermediate structural species preceding fibril formation. The causes of protein misfolding and the mechanisms underlying amyloid toxicity are not yet fully understood. However, increasing evidence suggests that oligomeric species contribute to β-cell toxicity through lipid membrane disruption. The role of lipid membranes in protein misfolding and aggregation pathways is increasingly recognized, as both accelerated aggregation and membrane disruption have been observed upon protein–lipid interactions. For IAPP, although the importance of lipid membranes in its aggregation pathway has been established, a detailed structural understanding of this interaction remains incomplete. As a first step toward elucidating the structural basis of the membrane-mediated IAPP aggregation pathway, we investigated the structure of monomeric IAPP upon membrane interaction using site-directed spin labeling. Our results show that membrane-bound IAPP adopts a single α-helical conformation spanning residues 9–22, while the N- and C-terminal regions remain less structured and do not form a well-defined secondary structure. In addition, we performed leakage assays to investigate membrane-disrupting properties of human IAPP, its analogs, and rat IAPP under different conditions. Membrane disruption depends on the concentration of negatively charged phospholipids. At high negative phospholipid content, both human and rat IAPP induce strong leakage. In contrast, at low negative phospholipid content, rat IAPP induces minimal leakage, whereas human IAPP remains active but with a more complex disruption mechanism. Finally, the expression and purification of a fusion protein (GB3-IAPP) are described. Efficient production of recombinant IAPP is essential for structural and biophysical studies of the peptide and will facilitate future investigations.

Η εναπόθεση αμυλοειδών πρωτεϊνών στους ιστούς αποτελεί χαρακτηριστικό πολλών ανθρώπινων νοσημάτων, όπως η νόσος του Parkinson, η νόσος του Huntington και ο σακχαρώδης διαβήτης τύπου II. Στον σακχαρώδη διαβήτη τύπου II, εναπόθεση αμυλοειδούς παρατηρείται στα β-κύτταρα του παγκρέατος, με κύριο συστατικό το ινσουλινοτροπικό αμυλοειδές πολυπεπτίδιο (IAPP). Σε όλες τις αμυλοειδοπάθειες, μια διαλυτή πρωτεΐνη υφίσταται λανθασμένη αναδίπλωση και σχηματίζει ινώδη β-πτυχωτά αμυλοειδή ινίδια. Η διαδικασία αυτή είναι πολυβηματική και εξαρτώμενη από πυρήνωση, ενώ προηγούνται διάφορα ενδιάμεσα δομικά είδη πριν από τον σχηματισμό ινιδίων. Τα αίτια της λανθασμένης αναδίπλωσης και ο μηχανισμός τοξικότητας των αμυλοειδών πρωτεϊνών δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί. Ωστόσο, πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ολιγομερείς δομές συμβάλλουν στην τοξικότητα των β-κυττάρων μέσω διαταραχής των λιπιδικών μεμβρανών. Η εμπλοκή των λιπιδικών μεμβρανών στη διαδικασία λανθασμένης αναδίπλωσης και συσσωμάτωσης γίνεται ολοένα και πιο αποδεκτή, καθώς έχει παρατηρηθεί επιτάχυνση της συσσωμάτωσης και διαταραχή μεμβρανών κατά την αλληλεπίδραση με αμυλοειδείς πρωτεΐνες. Στην περίπτωση του IAPP, αν και έχει αναγνωριστεί η σημασία των μεμβρανών, η λεπτομερής δομική κατανόηση της αλληλεπίδρασης παραμένει ελλιπής. Ως πρώτο βήμα προς την κατανόηση της δομής της μεμβρανικά μεσολαβούμενης οδού συσσωμάτωσης του IAPP, μελετήθηκε η δομή του μονομερούς IAPP κατά την αλληλεπίδραση με μεμβράνες, με χρήση site-directed spin labeling. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το IAPP υιοθετεί μία α-ελικοειδή δομή στα κατάλοιπα 9–22 όταν δεσμεύεται σε μεμβράνη, ενώ οι Ν- και C-τελικές περιοχές παραμένουν λιγότερο οργανωμένες. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν μελέτες διαρροής για την αξιολόγηση της ικανότητας διαταραχής μεμβρανών από ανθρώπινες και ρατινικές μορφές IAPP υπό διαφορετικές συνθήκες. Η διαταραχή εξαρτάται από την περιεκτικότητα της μεμβράνης σε αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια. Σε υψηλή περιεκτικότητα, τόσο το ανθρώπινο όσο και το ρατινικό IAPP προκαλούν ισχυρή διαρροή, ενώ σε χαμηλή περιεκτικότητα το ρατινικό IAPP είναι σχεδόν ανενεργό, σε αντίθεση με το ανθρώπινο που παραμένει δραστικό με πιο σύνθετο μηχανισμό. Τέλος, περιγράφεται η έκφραση και καθαρισμός ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σύντηξης GB3-IAPP, η οποία επιτρέπει την παραγωγή επαρκούς ποσότητας IAPP για δομικές και μοριακές μελέτες.