Ανάπτυξη μοριακών μεθόδων ανάλυσης

Abstract

The present PhD thesis strengthens the fields of Bioanalytical Chemistry and Nanotechnology and specifically focuses on the development of molecular analytical methods through the exploitation of nanoparticles as labels. The development of molecular analytical methods using catalytic nanoparticles constitutes an important research area with a wide range of applications including biomedical diagnostics, environmental monitoring and food safety control. Within this framework the dissertation focuses on the development of optical methods for the identification and quantitative determination of specific nucleic acid sequences using nanoparticles as signal enhancers, aiming at rapid and reliable detection. The PhD thesis is structured into a General Chapter and an Experimental Chapter. The General Part consists of four chapters. Chapter 1 presents the fundamental principles of molecular analytical methods including a historical overview of the most significant discoveries in molecular biology that established the foundations of the field. Chapter 2 describes the importance of molecular analytical methods and provides representative applications with emphasis on the fields of food and health. Chapter 3 analyzes key aspects of nucleic acid chemistry followed by an in-depth discussion of techniques for exponential amplification of specific sequences. The Theoretical Part concludes with Chapter 4 which presents analytical techniques for amplified products. This chapter discusses hybridization techniques, bioconjugation systems and molecular signal amplification strategies as well as analytical assay configurations. Finally types of DNA biosensors and labels are presented. This is followed by the aim of the PhD thesis and subsequently the Experimental Part, which consists of three chapters. The first experimental axis (Chapter 5) concerns the synthesis, surface modification and functional evaluation of cerium oxide nanoparticles with the aim of their application as labels in molecular analytical methods. Parameters affecting the conjugation of nanoparticles with biomolecules such as streptavidin and antibodies were systematically investigated, along with the effect of surface coating using biotinylated albumin. The study demonstrated that the functional response of the system is not determined solely by the concentration of individual components, but rather by the combined effect of surface density, biomolecular orientation, and conjugate purity. Emphasis was placed on the purification step of cerium oxide nanoparticle conjugates which led to a marked improvement in functional performance. These findings significantly contributed to the understanding of both the capabilities and limitations of cerium oxide nanoparticles as tracers and provided directions for future optimization. The second experimental part (Chapter 6) focuses on the development of a rapid molecular assay for tuna species identification, with application in food authenticity control. The proposed method is based on the exponential amplification of specific DNA sequences followed by their hybridization with sequence-specific oligonucleotide probes. Detection is achieved using gold nanoparticles, enabling direct visual readout without the need for specialized instrumentation. Analytical evaluation demonstrated high specificity and reproducibility, confirming stable performance even at low DNA concentrations. Furthermore, visual detection of adulteration at the level of 1% was achieved in thermally processed tuna samples which is particularly important for applications where morphological identification is not feasible. The results demonstrate that the developed assay combines ease of use with high analytical performance and is suitable for environments requiring rapid decision-making. The third experimental part (Chapter 7) aims at the design of a multiplex biosensor. The study extends to the development of a multiplex DNA biosensor capable of simultaneously detecting three tuna species examined in the previous chapter. The amplification of specific mitochondrial DNA sequences and their selective hybridization with multiple probes spatially arranged within the test zone of the biosensor enables the simultaneous identification of Thunnus albacares, Katsuwonus pelamis, and Thunnus thynnus within a single analytical procedure. Detection is again performed using gold nanoparticles, allowing direct visual interpretation of results without the need for specialized equipment. The development of the multiplex biosensor aims to enhance analytical efficiency and broaden the applicability of the method, providing a reliable tool for the authentication of tuna products and the detection of potential adulteration. Overall, the PhD thesis dissertation highlights the critical role of nanoparticle surface chemistry in the development of reliable bioanalytical systems while also presenting a comprehensive and applicable molecular method for food authenticity assessment.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή ενισχύει το πεδίο της Βιοαναλυτικής Χημείας και της Νανοτεχνολογίας και ειδικότερα εστιάζει στην ανάπτυξη μοριακών μεθόδων ανάλυσης με αξιοποίηση νανοσωματιδίων ως ιχνηθέτες. Η ανάπτυξη μοριακών μεθόδων ανάλυσης με χρήση καταλυτικών νανοσωματιδίων αποτελεί σημαντικό πεδίο έρευνας με ευρεία ποικιλία εφαρμογών που περιλαμβάνουν βιοϊατρικές διαγνώσεις, περιβαλλοντική παρακολούθηση και έλεγχο ασφάλειας τροφίμων. Στο πλαίσιο αυτό η διατριβή επικεντρώνεται στην ανάπτυξη οπτικών μεθόδων ανάλυσης ειδικών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων μέσω αξιοποίησης νανοσωματιδίων ως ενισχυτών σήματος με στόχο την ταχεία και αξιόπιστη ανίχνευση. Η διατριβή διαρθρώνεται σε Γενικό Μέρος και σε Πειραματικό Μέρος. Το Γενικό Μέρος περιλαμβάνει τέσσερα κεφάλαια. Στο Κεφάλαιο 1, παρουσιάζονται οι βασικές αρχές των μοριακών μεθόδων ανάλυσης με ιστορική αναδρομή στις σημαντικότερες ανακαλύψεις της μοριακής βιολογίας που έθεσαν τις βάσεις του πεδίου. Στο Κεφάλαιο 2, περιγράφεται η σημασία των μοριακών μεθόδων ανάλυσης και παρατίθενται ενδεικτικές εφαρμογές τους με έμφαση στον τομέα των τροφίμων και της υγείας. Στο Κεφάλαιο 3, αναλύονται στοιχεία χημείας των νουκλεϊκών οξέων και ακολουθεί εμβάθυνση στις τεχνικές εκθετικής ενίσχυσης ειδικών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων. Το Θεωρητικό Μέρος ολοκληρώνεται με το Κεφάλαιο 4, όπου παρουσιάζονται τεχνικές ανάλυσης προϊόντων εκθετικής ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων. Στο κεφάλαιο αυτό περιγράφονται τεχνικές υβριδοποίησης, συστήματα βιοσυζευγμάτων και μοριακής ενίσχυσης καθώς και διαμορφώσεις αναλύσεων. Τέλος παρουσιάζονται είδη βιοαισθητήρων DNA και ιχνηθετών. Ακολουθεί ο σκοπός της διδακτορικής διατριβής και στη συνέχεια το Πειραματικό Μέρος το οποίο περιέχει τρία κεφάλαια. Ο πρώτος πειραματικός άξονας (Κεφάλαιο 5) αφορά τη σύνθεση, την επιφανειακή τροποποίηση και τη λειτουργική αξιολόγηση νανοσωματιδίων οξειδίου του δημητρίου με στόχο την εφαρμογή τους ως ιχνηθέτών σε μοριακές μεθόδους ανάλυσης. Πραγματοποιήθηκε μελέτη των παραμέτρων που επηρεάζουν τη σύζευξη των νανοσωματιδίων με βιομόρια όπως η στρεπταβιδίνη και τα αντισώματα καθώς και της επίδρασης της επιφανειακής κάλυψης με βιοτινυλιωμένη αλβουμίνη. Η μελέτη ανέδειξε ότι η λειτουργική απόκριση του συστήματος δεν καθορίζεται αποκλειστικά από τη συγκέντρωση των επιμέρους συστατικών, αλλά από τον συνδυασμό επιφανειακής πυκνότητας, προσανατολισμού των βιομορίων και καθαρότητας των συζευγμάτων. Ιδιαίτερη σημασία αποδόθηκε στο στάδιο καθαρισμού των συζευγμάτων των νανοσωματιδίων δημητρίου το οποίο οδήγησε σε βελτίωση της λειτουργικής απόκρισης. Τα αποτελέσματα συνέβαλαν ουσιαστικά στην κατανόηση των δυνατοτήτων και των περιορισμών των νανοσωματιδίων δημητρίου ως ιχνηθέτες και παρείχε κατευθύνσεις για μελλοντική βελτιστοποίηση. Ο δεύτερος πειραματικός άξονας, Κεφάλαιο 6, επικεντρώνεται στην ανάπτυξη ταχείας μοριακής δοκιμής για την ταυτοποίηση ειδών τόνου με εφαρμογή στον έλεγχο αυθεντικότητας τροφίμων. Η προτεινόμενη μέθοδος βασίζεται στην εκθετική ενίσχυση ειδικών αλληλουχιών DNA και στην επακόλουθη υβριδοποίησή τους με ειδικούς ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές. Η ανίχνευση πραγματοποιείται μέσω νανοσωματιδίων χρυσού που επιτρέπουν άμεση οπτική ανάγνωση του αποτελέσματος, χωρίς ανάγκη εξειδικευμένου εξοπλισμού. Η αναλυτική αξιολόγηση της μεθόδου κατέδειξε υψηλή ειδικότητα και επαναληψιμότητα γεγονός που επιβεβαιώνει τη σταθερότητα της απόκρισης ακόμη και σε χαμηλές συγκεντρώσεις DNA. Επιπλέον επιτεύχθηκε οπτική ανίχνευση νοθείας σε επίπεδο 1 % σε θερμικά επεξεργασμένες μορφές τόνου, γεγονός ιδιαίτερα σημαντικό για εφαρμογές ελέγχου σε επεξεργασμένες μορφές τόνου όπου η μορφολογική ταυτοποίηση δεν είναι εφικτή. Τα αποτελέσματα τεκμηριώνουν ότι η αναπτυσσόμενη δοκιμή συνδυάζει απλότητα χρήσης με υψηλή αναλυτική επίδοση και δύναται να εφαρμοστεί σε περιβάλλοντα όπου απαιτείται ταχεία λήψη απόφασης. Ο τρίτος πειραματικός άξονας, Κεφάλαιο 7, στοχεύει στον σχεδιασμό ενός πολυαναλυτικού βιοαισθητήρα. Η παρούσα μελέτη επεκτείνεται στον σχεδιασμό και την ανάπτυξη ενός πολυαναλυτικού βιοαισθητήρα ικανού για την ανίχνευση τριών ειδών τόνου που μελετήθηκαν στο προηγούμενο κεφάλαιο. Η ενίσχυση ειδικών αλληλουχιών μιτοχονδριακού DNA και η εκλεκτική υβριδοποίησή τους με πολλαπλούς ανιχνευτές οι οποίοι είναι χωρικά οργανωμένοι στη ζώνη δοκιμής του βιοαισθητήρα καθιστά δυνατή την ταυτόχρονη αναγνώριση των ειδών Thunnus albacares, Katsuwonus pelamis και Thunnus thynnus σε μία μόνο αναλυτική διαδικασία. Η ανίχνευση πραγματοποιείται και στην περίπτωση αυτή μέσω νανοσωματιδίων χρυσού επιτρέποντας την άμεση οπτική ανάγνωση των αποτελεσμάτων χωρίς την ανάγκη εξειδικευμένου εξοπλισμού. Η ανάπτυξη του πολυαναλυτικού βιοαισθητήρα, αποσκοπεί στη βελτίωση της αποδοτικότητας της ανάλυσης και στη διεύρυνση της εφαρμοσιμότητας της μεθόδου, παρέχοντας ένα αξιόπιστο εργαλείο για τον έλεγχο της αυθεντικότητας προϊόντων τόνου και την ανίχνευση πιθανών φαινομένων νοθείας. Η διατριβή αναδεικνύει τον καθοριστικό ρόλο της επιφανειακής χημείας των νανοσωματιδίων στη διαμόρφωση αξιόπιστων βιοαναλυτικών συστημάτων και ταυτόχρονα παρουσιάζει ολοκληρωμένη και εφαρμόσιμη μοριακή μέθοδο για τον έλεγχο αυθεντικότητας τροφίμων.