Molecular and cellular basis of membrane trafficking mechanisms

Abstract

Eukaryotic cells rely on highly organized membrane trafficking pathways to ensure the correct sorting of neosynthesized proteins to specific cellular compartments. In polarized cells, such as the filamentous fungus Aspergillus nidulans, rapid apical growth must be coordinated with the uniform distribution of nutrient transporters along the hyphal plasma membrane (PM) to maintain cellular homeostasis and allow rapid nutrient uptake. Classical models of secretion propose that neosynthesized membrane proteins exit the endoplasmic reticulum (ER), transit through the Golgi apparatus, and are packaged into post-Golgi carriers for sorting to the PM. However, emerging evidence suggests that certain cargoes, particularly non-polarized cargoes such as the purine transporter UapA, can bypass the Golgi, revealing the existence of alternative, unconventional trafficking pathways .In this thesis, we systematically investigated the biogenesis, of polarized (SynA) versus non-polarized (UapA) membrane cargoes in A. nidulans. We developed a novel system enabling synchronous co-expression of both cargoes under the same regulatable promoter within the same genetic background. This approach allowed a direct, side-by-side comparison of their trafficking behaviors under identical growth and developmental conditions. Using this system, we demonstrated that polarized and non-polarized cargoes are segregated into distinct ER exit sites (ERES) and follow unconventional trafficking routes to the PM. Polarized cargoes such as SynA require conventional Golgi maturation, post-Golgi machinery, clathrin, microtubules, exocyst components, and canonical SNARE factors for their sorting to the apical PM of the hypahe. In contrast, UapA trafficking is largely independent of these conventional secretion components, although it partially relies on early Golgi factors, suggesting transient interactions with a CUPS-like (Compartment for Unconventional Protein Secretion - CUPS) intermediate compartment between the ER and the PM. Mechanistically, UapA ER exit is determined by cargo-intrinsic properties, including a highly specific N-terminal DYDY motif and oligomerization, which likely facilitate carrier formation and allow bypass of full COPII coat requirements. Mutational analyses indicate that the DYDY motif is sensitive to side-chain geometry and steric constraints rather than merely the presence of aromatic residues, suggesting that ER exit depends on defined conformational features of the cargo. To test the role of COPII components in cargo-specific ER exit, we systematically analyzed Sec24, the main COPII component responsible for cargo recognition. Mutagenesis of putative Sec24 cargo-binding sites revealed no specific defect in UapA trafficking, indicating that Sec24 is broadly required for COPII-mediated export but does not show selective recognition of UapA, supporting a cargo-centric model in which intrinsic properties of the transporter, such as oligomerization, define its ER exit and Golgi-bypass pathway. To investigate the structural basis of these carriers, we developed correlative cryo-fluorescence and cryo-electron tomography (cryo-CLEM/cryo-ET) methodologies, revealing ER-PM proximity consistent with direct delivery of Golgi-independent carriers. In addition, in vitro reconstitution of UapA in unilamellar liposomes provided a defined system to study transporter function and carrier properties under controlled membrane environments. Overall, this work establishes that Golgi-bypass trafficking in A. nidulans represents a cargo-centric, mechanistically distinct pathway that operates under physiological conditions to ensure uniform PM distribution of non-polarized membrane proteins. These findings revise the classical view of the secretory pathway, highlight the ER as an active sorting hub and provide a methodological framework for studying unconventional secretion. The approaches developed here, including synchronous cargo expression, genetic knockouts/knockdowns, high-resolution live-cell imaging, cryo-CLEM/cryo-ET, and in vitro reconstitution, lay the foundation for future investigations into the molecular mechanisms, carrier properties, and conservation of Golgi-independent trafficking across eukaryotic systems.

Τα ευκαρυωτικά κύτταρα εξαρτώνται από εξαιρετικά οργανωμένους μηχανισμούς μεταφοράς μεμβρανικών φορτίων για να διασφαλίσουν τη σωστή ταξινόμηση των νεοσυντιθεμένων πρωτεϊνών σε συγκεκριμένα υποκυτταρικά διαμερίσματα. Σε πολικά κύτταρα, όπως είναι και ο νηματώδης μύκητας Aspergillus nidulans, η ταχεία κορυφαία ανάπτυξη πρέπει να συντονίζεται με την ομοιόμορφη κατανομή των μεταφορέων θρεπτικών ουσιών κατά μήκος της μεμβράνης της υφής, προκειμένου να διατηρείται η κυτταρική ομοιόσταση και να επιτρέπεται η γρήγορη πρόσληψη θρεπτικών συστατικών. Τα κλασικά μοντέλα μεταφοράς μεμβρανικών φορτίων προτείνουν ότι οι νεοσυντιθεμένες μεμβρανικές πρωτεΐνες εξέρχονται από το ενδοπλασματικό δίκτυο, περνούν μέσα από το σύμπλεγμα Golgi και στη συνέχεια συσκευάζονται σε μεταφορείς μετά-Golgi για ταξινόμηση στην πλασματική μεμβράνη. Ωστόσο, νεότερα δεδομένα υποδηλώνουν ότι ορισμένα φορτία, ιδιαίτερα αυτά που έχουν μη πολική κατανομή στην πλασματική μεμβράνη, όπως ο μεταφορέας πουρινών UapA, μπορούν να παρακάμψουν το Golgi, αποκαλύπτοντας την ύπαρξη εναλλακτικών, μη συμβατικών μηχανισμών μεταφοράς. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, μελετήσαμε συστηματικά τη βιογένεση, την ταξινόμηση και τη μεταφορά πολικών (SynA) και μη πολικών (UapA) μεμβρανικών φορτίων στον πρότυπο οργανισμό A. nidulans. Αναπτύξαμε ένα νέο σύστημα που επιτρέπει τη συγχρονισμένη συνέκφραση και των δύο φορτίων υπό τον ίδιο ρυθμιζόμενο υποκινητή στο ίδιο γενετικό υπόβαθρο, επιτρέποντας άμεση, παράλληλη σύγκριση της συμπεριφοράς τους υπό ίδιες συνθήκες αύξησης και ανάπτυξης. Χρησιμοποιώντας αυτό το σύστημα, αποδείξαμε ότι τα πολικά και μη πολικά φορτία διαχωρίζονται σε διακριτές θέσεις εξόδου από το ενδοπλασματικό δίκτυο και ακολουθούν ανεξάρτητες, μη συμβατικές διαδρομές προς την πλασματική μεμβράνη. Τα πολικά φορτία, όπως το SynA, απαιτούν την κλασική ωρίμανση του Golgi, τα μετα-Golgi συστατικά, την κλαθρίνη, τους μικροσωληνίσκους, τα συστατικά του εξοκυστικού συμπλέγματος και τις SNARE πρωτεΐνες για την ταξινόμησή τους στην κορυφαία πλασματική μεμβράνη των υφών. Αντίθετα, η μεταφορά του UapA είναι κατά κύριο λόγο ανεξάρτητη από αυτά τα κλασικά στοιχεία έκκρισης, αν και εξαρτάται μερικώς από παράγοντες πρώιμου Golgi, υποδεικνύοντας παροδικές αλληλεπιδράσεις με ένα ενδιάμεσο διαμέρισμα τύπου CUPS (Compartment for Unconventional Protein Secretion - Διαμέρισμα για Μη-συμβατική Πρωτεϊνική Έκκριση) μεταξύ ενδοπλασματικού δικτύου και πλασματικής μεμβράνης.Μηχανιστικά, η έξοδος του UapA από το ενδοπλασματικό δίκτυο καθορίζεται από εγγενείς ιδιότητες του φορτίου, όπως ένα υψηλής εξειδίκευσης μοτίβο DYDY στο αμινοτελικό του άκρο και ο ολιγομερισμός του, που πιθανόν διευκολύνουν τον σχηματισμό του φορέα COPII. Οι αναλύσεις μεταλλάξεων υποδεικνύουν ότι το μοτίβο DYDY είναι ευαίσθητο στη γεωμετρία και τις στερεοχημικές περιοριστικές συνθήκες των πλευρικών αλυσίδων και όχι απλώς στην παρουσία αρωματικών αμινοξέων, υποδηλώνοντας ότι η έξοδος από το ER εξαρτάται από καθορισμένα χαρακτηριστικά της διαμόρφωσης του φορτίου. Για να διερευνηθεί ο ρόλος των συστατικών COPII στην ειδική για το φορτίο έξοδο από το ER, αναλύσαμε συστηματικά το Sec24, το κύριο συστατικό των COPII που ευθύνεται για την αναγνώριση των φορτίων. Η μεταλλαξιγένεση των θεωρητικών θέσεων σύνδεσης φορτίων του Sec24 δεν αποκάλυψε αναγνώριση ειδική για τον UapA, υποδηλώνοντας ότι το Sec24 δεν αναγνωρίζει γραμμικά μοτίβα, αλλά πιθανώς ανώτερες δομές, όπως είναι για παράδειγμα η τριτοταγής και τεταρτοταγής δομή των φορτίων. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν ένα μοντέλο που εστιάζει στο φορτίο, όπου εγγενείς ιδιότητες του μεταφορέα, όπως ο ολιγομερισμός, καθορίζουν την έξοδο από το ER και την παράκαμψη του Golgi. Η ανάλυση της δομής των φορέων μέσω συσχέτισης κρυο-φθορισμού και κρυο-ηλεκτρονικής τομογραφίας (cryo-CLEM/cryo-ET) αποκάλυψε εγγύτητα ενδοπλασματικού δικτύου και πλασματικής μεμβράνης συμβατή με άμεση παράδοση φορέων ανεξάρτητων του Golgi. Επιπλέον, η in vitro ανασύσταση του UapA σε λιποσώματα παρείχε ένα σύστημα για μελέτη της λειτουργίας του μεταφορέα και των ιδιοτήτων των φορέων σε ελεγχόμενα μεμβρανικά περιβάλλοντα. Συνολικά, η παρούσα εργασία καταδεικνύει ότι ο μηχανισμός παράκαμψης του συμπλέγματος Golgi στον A. nidulans αντιπροσωπεύει μία μηχανιστικά διακριτή διαδρομή που καθορίζεται κυρίως από το ίδιο το φορτίο και λειτουργεί υπό φυσιολογικές συνθήκες για να διασφαλίσει την ομοιόμορφη κατανομή μη πολικών μεμβρανικών πρωτεϊνών στην πλασματική μεμβράνη. Τα αποτελέσματα αυτά αναθεωρούν την κλασική άποψη της εκκριτικής οδού, τονίζουν το ενδοπλασματικό δίκτυο ως ενεργό κέντρο ταξινόμησης και παρέχουν ένα πλαίσιο για τη μελέτη μη συμβατικής έκκρισης. Οι προσεγγίσεις που αναπτύχθηκαν, συμπεριλαμβανομένης της συγχρονισμένης έκφρασης φορτίων, των γενετικών knockout/knockdown, της υψηλής ανάλυσης μικροσκοπίας, του cryo-CLEM/cryo-ET και της in vitro ανασύστασης, δημιουργούν τη βάση για μελλοντικές μελέτες σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς, τις ιδιότητες των φορέων και την εξελικτική συντήρηση του μηχανισμού μεταφοράς φορτίων παρακάμπτοντας το σύμπλεγμα Golgi σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς.