Οι πολυμορφισμοί των programmed cell death-1 (PD-1) rs 11568821, interleukin -28B (IL28B) rs12979860 και patatin-like phospholipase domain- containing protein 3 (PNPLA3) rs 738409 στην αυτοάνοση ηπατίτιδα

Abstract

Autoimmune hepatitis (AIH) is a relatively rare chronic liver disease. To date, no single pathophysiological hypothesis can comprehensively explain the entire spectrum of the disease. A unifying theory suggests that the initial triggering event, involving antigen selection, is influenced by human leukocyte antigen (HLA) II predisposition. Subsequently, polymorphisms in other immune regulatory and cytokine-producing genes including epigenetics may promote and perpetuate immune reactivity, loss of self-tolerance and inflammatory responses.The PD1 protein is involved in T-cell regulation and cytokine production favoring self-tolerance. A single nucleotide polymorphism rs11568821 (PD1.3) has been associated with several other autoimmune diseases. Data regarding PD1.3 in autoimmune liver disease are scarce. The IL28B rs12979860 polymorphism has been associated with the lipid profile, insulin resistance and the presence of hepatic steatosis in patients with HCV infection. It is also related with hepatic inflammation in both HCV and metabolic associated steatotic liver disease (MASLD). To the best of our knowledge the role of the IL28B rs12979860 in inflammatory response andliver damage has not been studied in autoimmune liver diseases. The PNPLA3 rs738409 (I148M) polymorphism has been associated with hepatic steatosis and progressive fibrosis in several chronic liver diseases apart MASLD. Limited available data support its role as a disease modifier in autoimmune liver disease as well. The aim of the present study was to investigate the prevalence and clinical significance of the above-mentioned polymorphisms in patients with AIH in order to extent current knowledge regarding how genetic background affectsthe disease. We also aimed at identifying possible new biomarkers that could aid in clinical decision-making and patient follow-up. Two hundred consecutive patients with well-established AIH followed in our Center were included in the study. One hundred age- and sex-matched healthy subjects served as controls. PD1.3 and IL28B rs12979860 genotyping was performed with in-house end-point allelic discrimination real time PCR using specific custom-made primers and minor groove binder probes. Results were confirmed by PCR - restriction fragment length polymorphism (RFLP) and direct sequencing, respectively. PNPLA3 I148M genotyping was also performed with end-point allelic discrimination RT- PCR with predetermined primers and minor groove binder probes designed for the specific polymorphism.PD1.3 was detected in 36/200 (18%) AIH patients and 28/100 (28%) healthy controls. No correlation was found with disease susceptibility, clinical phenotype or prognosis. Interestingly, patients not baring the polymorphism (GG homozygotes) suffered more frequently from concurrent extra-hepatic autoimmune diseases (p = 0.001), but without predisposition for a particulardisease. The distribution of IL28B rs12979860 genotypes in AIH patients [CC 79/200 (39.5%), TT 36/200 (18%), CT 85/200 (42.5%)] was similar with the control group [CC 42/100 (42%), TT 16/100 (16%), CT 42/100 (42%)]. CC patients had higher low-density lipoprotein (LDL) cholesterol levels (p=0.027), but no differences were found regarding the presence of steatosis, steatohepatitis or hepatic inflammation and fibrosis. The effect of IL28B rs12979860 on treatment response was significant, with CC patients achieving higher rates of complete biochemical remission at 12 months (88% vs. 69.2%, p=0.005) and higher treatment withdrawal rates (36.1% vs. 19.2%, p=0.020). The PNPLA3 rs738409 polymorphism was present in 95/200 (47.5%) patients with AIH and 47/100 (47%) healthy controls. Patients baring the I148M were more likely to present with decompensation at the time of diagnosis (6.3% vs. 1%, p=0.039) and tended to require longer immunosuppressive treatment before reaching remission (p=0.07). On Kaplan Meier analysis homozygosity for the G allele was associated with reduced survival free of decompensation (p=0.006), cirrhotic adverse events (decompensation, hepatocellular carcinoma) (p=0.001) and liver-related death or liver transplantation (p=0.011). In conclusion, the PD1.3 polymorphism does not seem to contribute to AIH susceptibility and disease course. Contrary, IL28B rs12979860 could pose as a novel biomarker for AIH, aiding clinicians in decision-making regarding treatment withdrawal in patients baring the “responder” genotype. Lastly, PNPLA3 rs738409 could be used as a surrogate marker to help identify AIH patients at increased risk for disease progression, allowing for personalized medical care.

Η αυτοάνοση ηπατίτιδα (AIH) είναι ένα σχετικά σπάνιο, χρόνιο ηπατικό νόσημα. Τόσο η αιτιοπαθογένεια όσο και οι μηχανισμοί που σχετίζονται με τους διαφορετικούς φαινοτύπους του νοσήματος είναι υπό διερεύνηση. Είναι ευρέως αποδεκτό πως γενετικοί παράγοντες αλληλοεπιδρούν με περιβαλλοντικά ερεθίσματα με αποτέλεσμα να προκαλείται μία συνεχής ανοσολογική επίθεση στο ήπαρ. Η πρωτεΐνη PD-1 ασκεί ανασταλτικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων και στην έκκριση φλεγμονωδών κυτταροκινών. Ο πολυμορφισμός rs11568821 (PD1.3) έχει συσχετιστεί με αριθμό αυτοάνοσων νοσημάτων όμως δεν υπάρχει πάρα μόνο μία αναφορά με περιορισμένο αριθμό ασθενών με αυτοάνοσα ηπατικά νοσήματα. Ο πολυμορφισμός IL28B rs12979860 έχει συσχετιστεί με την ηπατική φλεγμονώδη αντίδραση σε ασθενείς με ηπατίτιδα C όπως επίσης στεατωτική νόσο του ήπατος σχετιζόμενη με μεταβολική δυσλειτουργία (metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease, MASLD). Επιπλέον σχετίζεται με μηχανισμούς αντίστασης στην ινσουλίνη στο ήπαρ και με το μεταβολισμό των λιπιδίων σε ασθενείς με HCV λοίμωξη. Δεν υπάρχουν όμως διαθέσιμα δεδομένα για την πιθανή επίδραση του πολυμορφισμού σε ασθενείς με AIH. Ο πολυμορφισμός PNPLA3 rs738409 (I148M) έχει συσχετιστεί με την παρουσία στεάτωσης και την πρόοδο της ίνωσης σε πολλά χρόνια ηπατικά νοσήματα πέραν της MASLD. Λίγα διαθέσιμα δεδομένα υποστηρίζουν το ρόλο του ωςγενετικό τροποποιητή και στα αυτοάνοσα νοσήματα του ήπατος. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη της επίπτωσης των παραπάνω γενετικών πολυμορφισμών σε ασθενείς με AIH και της σημασίας αυτών στην κλινική εκδήλωση, την ανταπόκριση στη θεραπεία και την πρόγνωση της νόσου. Στόχος μας η διεύρυνση της γνώσης σχετικά με την επίδραση του γενετικού υπόβαθρου στην πορεία του νοσήματος και ενδεχομένως η ανάδειξη νέων βιοδεικτών που θα συμβάλλουν στην παρακολούθηση ή/και θα αποτελέσουν θεραπευτικούς στόχους για την αντιμετώπιση του νοσήματος. Μελετήθηκαν 200 ασθενείς με καλά τεκμηριωμένη ΑΙΗ που παρακολουθούνται στην Πανεπιστημιακή Παθολογική Κλινική και Ομώνυμο Ερευνητικό Εργαστήριο, Κέντρο Εμπειρογνωμοσύνης για τα Αυτοάνοσα Νοσήματα Ήπατος, Πλήρες Μέλος του Ευρωπαϊκού Δικτύου ERN-RARE Liver, Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Λάρισας. Ως ομάδα ελέγχουχρησιμοποιήθηκαν 100 υγιείς μάρτυρες. Για τη γονοτυπική ανάλυση των PD1.3 rs11568821 και IL28B rs12979860 αναπτύχθηκαν πρότυποι in-house μέθοδοι αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο σε συνδυασμό με ειδικούς ανιχνευτές και εκκινητές οι οποίοι εστιάζονται στις επιθυμητές περιοχές του γονιδιώματος (end-point allelic discrimination RΤ-PCR). Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με PCR- restriction fragment length polymorphism (RFLP) και άμεση αλληλούχηση αντίστοιχα. Η γονοτυπική ανάλυση της PNPLA3 I148M πραγματοποιήθηκε επίσης με end point RT-PCR με κατάλληλους εκκινητές και ανιχνευτές. Ο πολυμορφισμός PD1.3 εντοπίστηκε σε 36/200 (18%) ασθενείς με AIH και σε 28/100 (28%) υγιείς μάρτυρες. Δεν αναγνωρίστηκε καμία συσχέτισή του πολυμορφισμού με την επίπτωση, την κλινική εκδήλωση ή την πρόγνωση του νοσήματος. Οι ασθενείς που έφεραν το φυσιολογικό γονότυπο (PD1) έπασχαν συχνότερα από εξωηπατικά αυτοάνοσα νοσήματα (p=0.001) χωρίς προδιάθεση για κάποιο συγκεκριμένο νόσημα. Η κατανομή των γονοτύπων της IL28B rs12979860 στους ασθενείς με AIH [CC 79/200 (39.5%), TT 36/200 (18%), CT 85/200 (42.5%)] ήταν παρόμοια με αυτή του γενικού πληθυσμού [CC 42/100 (42%), TT 16/100 (16%), CT 42/100 (42%)] . Ο γονότυπος CC σχετίστηκε με υψηλότερες τιμές LDL χοληστερόλης (p=0.027), αλλά δεν εντοπίστηκαν διαφορές στο βαθμό στεάτωσης, ηπατικής φλεγμονής ή ίνωσης. Σημαντικός αναδείχθηκε ο ρόλος του πολυμορφισμού στην απάντηση στην ανοσοτροποποιητική αγωγή καθώς oι ασθενείς με γονότυπο CC παρουσίαζαν υψηλότερα ποσοστά πλήρους βιοχημικής ανταπόκρισης στους 12 μήνες αγωγής (88% έναντι 69.2%, p=0.005) και μεγαλύτερα ποσοστά πλήρους απόσυρσης της ανοσοτροποποιητικής αγωγής (36.1% έναντι 19.2%, p=0.020).Ο πολυμορφισμός PNPLA3 rs738409 ανιχνεύθηκε σε 95/200 (47.5%) ασθενείς και σε 47/100 (47%) υγιείς μάρτυρες. Οι ασθενείς που έφεραν τον πολυμορφισμό I148M παρουσίαζαν πιο συχνά ρήξη της αντιρρόπησης κατά τη διάγνωση (6.3% έναντι 1%, p=0.039) και έτειναν να χρειάζονται μεγαλύτερα διαστήματα ανοσοτροποιητικής αγωγής μέχρι την επίτευξη πλήρους βιοχημικής ανταπόκρισης (p=0.07). Στην ανάλυση Kaplan Meier η ομοζυγωτία για το αλλήλιο G σχετίστηκε με μειωμένη επιβίωση ελεύθερη ρήξης της αντιρρόπησης (p=0.006), κιρρωτικών επιπλοκών (ρήξη αντιρρόπησης, ανάπτυξη ηπατοκυτταρικού καρκίνου) (p=0.001) και θάνατο από ηπατικά αίτια ή μεταμόσχευση ήπατος (p=0.011), ασχέτως της παρουσίας MASLD. Συμπερασματικά, ο πολυμορφισμός PD1.3 δε φαίνεται να έχει επιδραστικό ρόλο στην κλινική εκδήλωση της AIH. Αντιθέτως ο πολυμορφισμός IL28B rs12979860 θα μπορούσε να αποτελέσει ένα νέο βιοδείκτη που θα συνδράμει στη λήψη κλινικών αποφάσεων για τη μείωση και την οριστική διακοπή της ανοσοτροποποιητικής αγωγής σε ασθενείς με τον ευνοϊκό γονότυπο. Τέλος, ο πολυμορφισμός PNPLA3 rs738409 μπορεί να αναγνωρίσει ασθενείς με ΑΙΗ σε αυξημένο κίνδυνο για πρόοδο νόσου και δυσμενή έκβαση διευκολύνοντας έτσι την παροχή εξατομικευμένης φροντίδας.