Επίδραση της χορήγησης υδροξυχλωροκίνης στα ουδετερόφιλα και στην ανάπτυξη των εξωκυτταρίων παγίδων ουδετεροφίλων (Neutrophil Extracellular Traps-NETs) σε ιστούς ApoE knockout ποντικιών

Abstract

Introduction: Hydroxychloroquine (HCQ) has been associated with lower incidence of cardiovascular events and better clinical renal outcomes in patients with autoimmune diseases, while in mouse models it has been shown to reduce atherosclerosis progression and kidney damage. HCQ is a potent autophagy inhibitor, while previous data have also shown that HCQ might inhibit neutrophil extracellular traps (NETs) release. Nevertheless, the data regarding its effect in atherosclerotic plaque and kidneys are scarce. Our study aimed at investigating the effect of HCQ on autophagy and NET formation in aortas and kidneys of ApoE-/- mice. Methods: ApoE-/- mice were treated with 10mg/kg/day HCQ for 16 weeks. The aortas and kidneys were examined histologically, while immunofluorescence staining and confocal microscopy were performed to identify the co-localization of myeloperoxidase (MPO) with DNA or microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3B (LC3B) as markers of NET formation and autophagy, respectively. Results: Among 52 ApoE-/- mice (30 male, 22 female), HCQ was administered in 15 male and 12 female mice. HCQ was associated with a significant reduction in the mean (±SD) surface of the atherosclerotic plaque compared to controls (HCQ–treated vs. control, 0.04±0.01mm2 vs. 0.08±0.04 mm2, p<0.01 and 0.06±0.04 mm2 vs. 0.15±0.09 mm2, p=0.012, for male and female respectively). This reduction was associated with a significant attenuation in the mean fluorescence intensity of MPO and LC3B expression of the atherosclerotic plaque of HCQ treated mice (p=0.03 and p=0.01, respectively). In line with these findings, HCQ significantly reduced the proportion of MPO⁺ and LC3B⁺ cells within the atherosclerotic lesions. Renal histopathological examination of the control group showed a diffusely thick glomerular basement membrane, with concomitant mesangial hypercellularity and increased mesangial matrix in the majority of glomeruli. Fibrosis of the interstitium with minimal lymphoplasmacytic infiltrate was occasionally detected. HCQ treatment decreased the mesangial cellularity and was associated with a significant increase in corpuscle area (μm2) in male and female mice, compared to controls (HCQ males 6686± 2588 μm2 vs. control males 4614 ± 1270 μm2, p=0.035, HCQ females 5527 ± 2064 μm2 vs. control females 3815 ± 786 μm2, p=0.039). Moreover, HCQ treatment resulted in attenuation of the interstitial fibrosis and was associated with a significant increase in glomerular circularity in males (HCQ males 0.87 ± 0.31 vs. control males 0.81 ± 0.08 μm2, p=0.013) but not in female mice (HCQ females 0.88 ± 0.23 vs. control females 0.86 ± 0.02, p=0.079). These findings were associated with a significant attenuation in the mean fluorescence intensity of MPO and LC3B expression in the glomeruli of HCQ treated mice (p=0.007 and p=0.041, respectively). Discussion: HCQ administration in ApoE-/- mice may mitigate the progression of atherosclerotic plaque and improve kidney histology, by inhibiting autophagy and NET formation. A potential mechanistic explanation would be that HCQ affects lysosomal pH and thus inhibiting autophagy, which is the important “second hit” to neutrophils in order to activate their granules, decondense their chromatin and release NETs. Simultaneously, HCQ has been shown to reduce the activity of PAD4, an enzyme which is responsible for the citrullination of histones and the decondensation of DNA and the release of NETs. After the inhibition of PAD4 by HCQ, histones remain firmly adhered to chromatin not allowing their unpacking and thus the release of NETs. Hydroxychloroquine–mediated inhibition of autophagy and PAD4 may contribute to the attenuation of atherosclerotic plaque progression and renal disease among patients with chronic inflammatory diseases or cardiovascular risk factors with increased residual inflammation despite best medical treatment.

Εισαγωγή: Η υδροξυχλωροκίνη (HCQ) έχει συσχετιστεί με χαμηλότερη επίπτωση καρδιαγγειακών συμβαμάτων και όφελος στη νεφρική λειτουργία ασθενών με αυτοάνοσα ρευματικά νοσήματα. Αντίστοιχα, σε πειραματικά μοντέλα ποντικιών έχει αποδειχθεί ότι μπορεί να μειώσει την εξέλιξη της αθηροσκλήρωσης και τη νεφρική βλάβη. Η HCQ είναι ισχυρός αναστολέας της αυτοφαγίας, ενώ πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι μπορεί να αναστείλει και την απελευθέρωση εξωκυττάριων παγίδων ουδετεροφίλων (neutrophil extracellular traps, NETs). Παρ’ όλα αυτά, τα δεδομένα σχετικά με την επίδρασή της στην αθηροσκληρωτική πλάκα και τους νεφρούς αλλά και τη συσχέτιση αυτών με την αυτοφαγία και τα NETs είναι περιορισμένα. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει την επίδραση της HCQ στην αυτοφαγία και στο σχηματισμό NETs στην αθηροσκληρωτική πλάκα της αορτής και στους νεφρούς ApoE-/- ποντικιών. Μέθοδοι: Ποντίκια C57BL/6 ApoE-/- διαχωρίστηκαν σε δύο ομάδες. Στην ομάδα του φαρμάκου τα ποντίκια έλαβαν HCQ σε δόση 10 mg/kg/ημέρα για 16 εβδομάδες στο πόσιμο νερό, ενώ στην ομάδα ελέγχου έλαβαν νερό χωρίς HCQ. Οι αορτές και οι νεφροί εξετάστηκαν ιστολογικά, ενώ πραγματοποιήθηκαν ανοσοφθορισμός και συνεστιακή μικροσκοπία για την αναγνώριση της συνύπαρξης της μυελοϋπεροξειδάσης (MPO) με DNA ή με τη microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3B (LC3B), ως δείκτες σχηματισμού NETs και αυτοφαγίας, αντίστοιχα. Αποτελέσματα: Από 52 ApoE-/- ποντίκια (30 αρσενικά, 22 θηλυκά), HCQ χορηγήθηκε σε 15 αρσενικά και 12 θηλυκά. Η HCQ συσχετίστηκε με σημαντική μείωση της μέσης (±SD) επιφάνειας της αθηροσκληρωτικής πλάκας σε σύγκριση με τους μάρτυρες (HCQ έναντι ελέγχου: 0,04±0,01 mm² έναντι 0,08±0,04 mm², p<0,01 στους αρσενικούς και 0,06±0,04 mm² έναντι 0,15±0,09 mm², p=0,012 στις θηλυκές). Η μείωση αυτή συνοδεύτηκε από σημαντική ελάττωση της μέσης έντασης φθορισμού (mean fluorescence intensity, MFI) της έκφρασης MPO και LC3B στην αθηροσκληρωτική πλάκα των ποντικιών που έλαβαν HCQ (p=0,03 και p=0,01, αντίστοιχα). H HCQ μείωσε σημαντικά και το ποσοστό των MPO⁺ και LC3B⁺ κυττάρων εντός των αθηροσκληρωτικών βλαβών.Στην ιστοπαθολογική εξέταση των νεφρών της ομάδας ελέγχου, παρατηρήθηκε διάχυτη πάχυνση της σπειραματικής βασικής μεμβράνης, με ταυτόχρονη μεσαγγειακή κυτταροβρίθεια και αύξηση της μεσαγγειακής ουσίας στη πλειονότητα των σπειραμάτων. Κατά τόπους ανιχνεύθηκε ίνωση του διάμεσου ιστού με ελάχιστη λεμφοπλασματοκυτταρική διήθηση. Η χορήγηση HCQ μείωσε τη μεσαγγειακή κυτταροβρίθεια και συσχετίστηκε με σημαντική αύξηση της επιφάνειας του νεφρικού σωματίου (μm²) σε αρσενικά και θηλυκά ποντίκια σε σύγκριση με τους μάρτυρες (αρσενικοί: 6686±2588 μm² έναντι 4614±1270 μm², p=0,035· θηλυκές: 5527±2064 μm² έναντι 3815±786 μm², p=0,039). Επιπλέον, η HCQ οδήγησε σε ελάττωση της διάμεσης ίνωσης και συσχετίστηκε με σημαντική βελτίωση της δομής του σπειράματος στους αρσενικά (0,87±0,31 έναντι 0,81±0,08, p=0,013), αλλά όχι στα θηλυκά ποντίκια (0,88±0,23 έναντι 0,86±0,02, p=0,079). Τα ευρήματα αυτά συνοδεύτηκαν από σημαντική ελάττωση της MFI των MPO και LC3B στα σπειράματα των ποντικιών που έλαβαν HCQ (p=0,007 και p=0,041, αντίστοιχα). Συζήτηση: Η χορήγηση HCQ σε ποντίκια ApoE-/- ενδέχεται να μετριάζει την εξέλιξη της αθηροσκληρωτικής πλάκας και να βελτιώνει τη νεφρική ιστολογία, μέσω αναστολής της αυτοφαγίας και του σχηματισμού NETs. Μια πιθανή παθοφυσιολογική εξήγηση είναι ότι η HCQ επηρεάζει το pH των λυσοσωμάτων, αναστέλλοντας έτσι την αυτοφαγία, η οποία αποτελεί ένα σημαντικό «δεύτερο χτύπημα» στα ουδετερόφιλα για την ενεργοποίηση των κοκκίων τους, την αποσυμπύκνωση της χρωματίνης και την απελευθέρωση NETs. Παράλληλα, έχει διαπιστωθεί ότι η HCQ μειώνει τη δραστηριότητα της PAD4, ενός ενζύμου υπεύθυνου για την απαμιδίωση (ή κιτρουλλίνωση) των ιστονών και, συνεπώς, για την αποσυμπύκνωση του DNA και την απελευθέρωση των NETs. Μετά την αναστολή της PAD4 από την HCQ, οι ιστόνες παραμένουν σταθερά προσδεδεμένες στη χρωματίνη, εμποδίζοντας το «ξετύλιγμά» τους και έτσι, την απελευθέρωση NETs. Η αποτελεσματική αναστολή της αυτοφαγίας και της PAD4 από την HCQ μπορεί να συμβάλλει στη μείωση της εξέλιξης της αθηροσκληρωτικής νόσου και της νεφρικής βλάβης σε ασθενείς με χρόνια φλεγμονώδη νοσήματα ή καρδιαγγειακούς παράγοντες κινδύνου, οι οποίοι εμφανίζουν επίμονη υπολειπόμενη φλεγμονή παρά τη βέλτιστη φαρμακευτική αγωγή.