Δομικές μελέτες λιποξυγονασών με χρήση ολοκληρωμένων προσεγγίσεων

Abstract

Lipoxygenases (LOXs) are non-heme iron enzymes that catalyze the stereospecific dioxygenation of polyunsaturated fatty acids, producing lipid hydroperoxides that serve as precursors of important signalling mediators. Due to their involvement in inflammation, oxidative stress, and metabolic regulation, LOXs represent important biological and pharmacological targets. In this doctoral thesis, soybean lipoxygenase-1 (sLOX1) is employed as a structural and functional model for human LOX isoforms, aiming to elucidate the physicochemical determinants of enzyme stability, aggregation, and inhibition. A systematic experimental study was performed to investigate the effect of buffer composition, ionic strength, and temperature on the stability and catalytic performance of sLOX1. Enzyme activity tests were combined with biophysical techniques, including fluorescence spectroscopy, Fourier-transform infrared spectroscopy, and light scattering, to monitor structural changes, thermal stability, and aggregation behaviour. The results demonstrate that subtle changes in solution conditions critically affect enzyme stability and activity. In parallel, the inhibitory potential of selected molecules was explored using an integrated computational and experimental approach. Molecular docking and molecular dynamics simulations were employed to characterize binding modes, interactions, and flexibility of enzyme–inhibitor complexes, revealing key structural determinants of inhibition. A rapid colorimetric method specific for sLOX isozymes was applied and optimized, enabling the qualitative screening and functional characterization of sLOX1 inhibitors. Overall, this work establishes a comprehensive framework for the structural, biophysical, and mechanistic characterization of sLOX1, contributing to a deeper understanding of lipoxygenase structure–function relationships and supporting the rational development of selective inhibitors with potential biomedical and industrial relevance.

Οι λιποξυγονάσες (LOX) είναι μη-αιμικά ένζυμα που καταλύουν τη στερεοειδική διοξυγόνωση των πολυακόρεστων λιπαρών οξέων, παράγοντας υδροϋπεροξείδια λιπιδίων που χρησιμεύουν ως μεσολαβητές σηματοδότησης. Λόγω της συμμετοχής τους στη φλεγμονή, το οξειδωτικό στρες και τη μεταβολική ρύθμιση, οι LOX αποτελούν σημαντικούς βιολογικούς και φαρμακολογικούς στόχους. Σε αυτή τη διδακτορική διατριβή, η λιποξυγονάση-1 του καρπού της σόγιας (sLOX1) χρησιμοποιείται ως δομικό και λειτουργικό μοντέλο για τις ισομορφές LOX του ανθρώπου, με στόχο την αποσαφήνιση των φυσικοχημικών παραγόντων της σταθερότητας, της συσσωμάτωσης και της αναστολής του ενζύμου. Διενεργήθηκε συστηματική πειραματική μελέτη για να διερευνηθεί η επίδραση του ρυθμιστικού διαλύματος, της ιοντικής ισχύος και της θερμοκρασίας στη σταθερότητα και την καταλυτική ικανότητα της sLOX1. Οι δοκιμές ενζυμικής δραστικότητας συνδυάστηκαν με βιοφυσικές τεχνικές, όπως φασματοσκοπία φθορισμού, φασματοσκοπία υπέρυθρου μετασχηματισμού Fourier και σκέδαση φωτός, προκειμένου να παρακολουθηθούν οι δομικές αλλαγές, η θερμική σταθερότητα και η συμπεριφορά συσσωμάτωσης. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι οι μικρές αλλαγές στις συνθήκες του διαλύματος επηρεάζουν σημαντικά τη σταθερότητα του ενζύμου και τη δραστικότητά του. Παράλληλα, διερευνήθηκε η ανασταλτική ικανότητα επιλεγμένων μορίων χρησιμοποιώντας μια ολοκληρωμένη υπολογιστική και πειραματική προσέγγιση. Χρησιμοποιήθηκαν προσομοιώσεις μοριακής πρόσδεσης και μοριακής δυναμικής για τον χαρακτηρισμό των τρόπων σύνδεσης, τις αλληλεπιδράσεις και της ευελιξίας των συμπλοκών ενζύμου-αναστολέα, αποκαλύπτοντας βασικούς δομικούς καθοριστικούς παράγοντες της αναστολής. Εφαρμόστηκε και βελτιστοποιήθηκε μια ταχεία χρωματομετρική μέθοδος, ειδική για τις ισοένζυμες LOX του καρπού της σόγιας, επιτρέποντας την ποιοτική διαλογή και τον λειτουργικό χαρακτηρισμό των αναστολέων sLOX1. Συνολικά, η εργασία αυτή καθιερώνει ένα ολοκληρωμένο πλαίσιο για τον δομικό, βιοφυσικό και μηχανιστικό χαρακτηρισμό της sLOX1, συμβάλλοντας σε μια βαθύτερη κατανόηση των σχέσεων δομής-λειτουργίας της λιποξυγονάσης και υποστηρίζοντας την ορθολογική ανάπτυξη επιλεκτικών αναστολέων με πιθανή βιοϊατρική και βιομηχανική σημασία.