Mελέτη της αλληλεπίδρασης των ιών Flaviviridae και άλλων RNA ιών, όπως ο SARS-CoV-2, με σηματοδοτικά μονοπάτια του κυττάρου και εφαρμογή σε θεραπευτικές προσεγγίσεις

Abstract

Objective: The overarching aim of the present doctoral thesis is to investigate the interaction of the RNA viruses HCV, DENV, and SARS-CoV-2 with the key cellular signaling pathways of hypoxia and catecholamine biosynthesis and metabolism, with the goal of identifying novel molecular mechanisms of viral pathogenesis. Introduction: Hepatitis C virus (HCV) and dengue virus (DENV) belong to the Flaviviridae family and constitute major causative agents of severe diseases with high mortality rates worldwide. Both pathogens possess a single-stranded positive-sense RNA genome, and their life cycle takes place exclusively in the cytoplasm of the host cell. Despite significant advances in the development of antiviral therapies against HCV in recent years, major challenges remain, including the high cost of treatment, the emergence of resistant strains, and the persistent risk of hepatocellular carcinoma development. Furthermore, the lack of approved specific therapies for DENV, combined with the frequent occurrence of co-infections, particularly in geographical regions with high prevalence of both viruses, highlights the urgent need for the identification of novel effective therapeutic targets. The recent COVID-19 pandemic underscored the importance of an in-depth understanding of the molecular nodes governing the interaction between the RNA virus SARS-CoV-2 and the host, given the functional and structural similarities of its life cycle to those of HCV and DENV. Within the framework of a long-standing collaboration between the Laboratory of Molecular Virology of the Hellenic Pasteur Institute and the Section of Biochemistry and Molecular Biology of the National and Kapodistrian University of Athens, experimental data suggested a potential association between infection by the aforementioned viruses and the function of the catecholamine biosynthetic and metabolic pathway. Specifically, a regulatory association was identified between HCV and DENV infection and the expression of L-Dopa decarboxylase (DDC), an enzyme responsible for dopamine biosynthesis. This finding was attributed, at least in part, to the physical interaction of DDC with the p55 regulatory subunit of phosphoinositide 3-kinase (PI3K), a central component of the PI3K/AKT signaling pathway. In parallel, published studies from the same research group demonstrated that replication of HCV and DENV is enhanced under hypoxic conditions, while reduced oxygen tension exerts a suppressive effect on DDC expression levels.Specific Objectives: Taking these findings into account, the present doctoral thesis investigated: (a) the involvement of hypoxia-inducible factors (HIFs) in the suppression of L-Dopa decarboxylase (DDC) expression observed during viral infection, (b) the functional significance of DDC biosynthetic activity in viral replication, and (c) based on the statistically significant co-expression of DDC with the ACE2 locus, which encodes the receptor protein mediating SARS-CoV-2 entry into host cells, as well as data indicating interactions of viral proteins with monoamine oxidase A (MAO-A) and the involvement of catechol-O-methyltransferase (COMT) in infection, the association of DDC with SARS-CoV-2 infection was examined for the first time, both in cultured epithelial cells and in clinical patient samples. Summary of Results and Conclusions: The experimental findings of this doctoral thesis attributed the negative impact of HCV and DENV infection on L-Dopa decarboxylase (DDC) expression levels to the activity of hypoxia-inducible factors (HIFs). This conclusion was supported by the observation that the presence of an HIF inhibitor attenuated the infection-induced reduction in DDC protein levels. Furthermore, the critical role of DDC biosynthetic function in suppressing the replication of these viruses was demonstrated. Specifically, enhanced viral proliferation was observed in cellular systems where DDC gene expression was silenced, accompanied by a reduction in the inhibitory effect of the enzyme substrates L-Dopa and 5-hydroxytryptophan (5-HTP) on viral replication in the same cells. In addition, exogenous administration of dopamine resulted in a significant suppression of viral replication, an effect shown to be independent of dopamine D2 receptor signaling. Notably, chemical inhibition of dopamine transporters led to increased replication of both viruses, a finding attributed to reduced uptake of the molecule from the extracellular environment. Moreover, in the case of HCV, dopamine exerted its antiviral effect through modulation of intracellular reactive oxygen species (ROS) levels. Specifically, co-administration of dopamine and reduced glutathione, a widely used antioxidant, abolished the effect of dopamine on viral propagation. In contrast, during DENV infection, although the importance of intracellular dopamine accumulation was confirmed, its antiviral effect was found to be independent of ROS regulation. The association between SARS-CoV-2 infection and L-Dopa decarboxylase (DDC) expression, as well as the broader catecholamine biosynthetic and metabolic pathway, was investigated in both clinical patient samples and cultured cell models. In patients with mild or asymptomatic COVID-19, increased DDC expression was observed compared to the negative control group, alongside a statistically significant inverse correlation between DDC levels and viral RNA. Additionally, strong correlations were detected between DDC expression and the dACE2 gene, an interferon-inducible isoform of ACE2, suggesting a potential role of DDC in a coordinated antiviral immune response of the host cell. In contrast, patients with severe COVID-19 exhibited marked suppression of DDC expression, with levels even lower than those of the control group. These findings identify DDC, for the first time, as a reliable molecular prognostic biomarker of COVID-19 disease severity. Furthermore, patient samples from severe cases revealed extensive alterations in dopamine biosynthesis and metabolism, including decreased DDC expression and increased mRNA levels of monoamine oxidases A and B (MAO-A and MAO-B), enzymes involved in dopamine catabolism. These data underscore the importance of dopamine as a potential regulatory factor in viral infection. These findings were further validated in infected VeroE6 epithelial cells derived from the kidney of the African green monkey (Chlorocebus sabaeus). Moreover, consistent with observations in HCV and DENV, exogenous administration of non-cytotoxic concentrations of dopamine or L-Dopa in infected cells led to a significant reduction in SARS-CoV-2 spread, as evidenced by decreased virus-induced cytopathic effects. Administration of L-Dopa or dopamine may therefore represent a potential antiviral strategy, particularly in immunocompromised patients, a condition associated with increased SARS-CoV-2 viral loads. In conclusion, the collective findings of this doctoral thesis demonstrate a direct link between neuromolecules and viral infections.

Σκοπός: Γενικός σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η διερεύνηση της αλληλεπίδρασης των RNA ιών HCV, DENV και SARS-CoV-2 με τα κυτταρικά μονοπάτια σηματοδότησης της υποξίας και της βιοσύνθεσης/μεταβολισμού των κατεχολαμινών, με στόχο την ανάδειξη νέων μοριακών μηχανισμών ιικής παθογένειας. Εισαγωγή: Οι ιοί της ηπατίτιδας C (HCV) και του δάγκειου πυρετού (DENV) ανήκουν στην οικογένεια των Φλαβοϊών (Flaviviridae) και αποτελούν σημαντικούς αιτιολογικούς παράγοντες σοβαρών νοσημάτων με υψηλά ποσοστά θνησιμότητας σε παγκόσμια κλίμακα. Αμφότεροι οι ιοί διαθέτουν μονόκλωνο RNA θετικής πολικότητας ως γονιδίωμα και ο κύκλος ζωής τους εκτυλίσσεται αποκλειστικά στο κυτταρόπλασμα του ξενιστή. Παρά τη σημαντική πρόοδο που έχει επιτευχθεί τα τελευταία χρόνια στην ανάπτυξη αντιικών θεραπειών έναντι του HCV, εξακολουθούν να υφίστανται σοβαρές προκλήσεις, όπως το υψηλό κόστος της θεραπείας, η εμφάνιση ανθεκτικών στελεχών και ο διαρκής κίνδυνος ανάπτυξης ηπατοκυτταρικού καρκίνου. Επιπλέον, η απουσία εγκεκριμένων ειδικών θεραπειών για τον ιό DENV, σε συνδυασμό με τη συχνή εμφάνιση συμμολύνσεων, ιδιαίτερα σε γεωγραφικές περιοχές με υψηλό επιπολασμό και των δύο ιών, υπογραμμίζει την επιτακτική ανάγκη για την ανακάλυψη νέων αποτελεσματικών θεραπευτικών στόχων. Η πρόσφατη πανδημία COVID-19 κατέδειξε τη σημασία της εις βάθος κατανόησης των μοριακών μηχανισμών αλληλεπίδρασης του RNA ιού SARS-CoV-2 με τον κυτταρικό ξενιστή, δεδομένων και των λειτουργικών και δομικών ομοιοτήτων που παρουσιάζει ο κύκλος ζωής του με εκείνον των ιών HCV και DENV. Στο πλαίσιο της πολυετούς συνεργασίας του Εργαστηρίου Μοριακής Ιολογίας του Ελληνικού Ινστιτούτου Παστέρ με τον Τομέα Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, πειραματικά δεδομένα ανέδειξαν πιθανή συσχέτιση της λοίμωξης από τους προαναφερθέντες ιούς με τη λειτουργία του βιοσυνθετικού και μεταβολικού μονοπατιού των κατεχολαμινών. Ειδικότερα, αναδείχθηκε η ύπαρξη ρυθμιστικής συσχέτισης μεταξύ της λοίμωξης από τους ιούς HCV και DENV και της έκφρασης της L-Dopa αποκαρβοξυλάσης (DDC), μόριο το οποίο βιοσυνθέτει την ντοπαμίνη. Το συγκεκριμένο εύρημα αποδόθηκε, τουλάχιστον εν μέρει, στη φυσική αλληλεπίδραση της DDC με την p55 ρυθμιστική υπομονάδα της κινάσης της 3-φωσφατιδυλο-ινοσιτόλης (PI3K), μίας εκ των κεντρικών πρωτεϊνών του σηματοδοτικού μονοπατιού PI3K/Akt. Παράλληλα, δημοσιευμένες μελέτες της ίδιας ερευνητικής ομάδας κατέδειξαν ότι η αντιγραφή των ιών HCV και DENV ενισχύεται υπό συνθήκες υποξίας, ενώ ταυτόχρονα παρατηρήθηκε κατασταλτική επίδραση της μειωμένης μερικής τάσης οξυγόνου στα επίπεδα έκφρασης της DDC. Ειδικοί στόχοι: Λαμβάνοντας υπόψη τα ανωτέρω ευρήματα, στο πλαίσιο της παρούσας Διδακτορικής διατριβής διερευνήθηκαν: α) η εμπλοκή των παραγόντων που επάγονται από την υποξία (HIFs) στην καταστολή της έκφρασης της L-Dopa αποκαρβοξυλάσης (DDC), η οποία παρατηρείται κατά τη διάρκεια της ιογενούς λοίμωξης, β) η λειτουργική σημασία της βιοσυνθετικής δραστηριότητας της DDC ως προς τον πολλαπλασιασμό των ιών, και γ) βασιζόμενοι στη στατιστικά σημαντική συσχετισμένη έκφραση της DDC με τον γενετικό τόπο του υποδοχέα ACE2, ο οποίος κωδικοποιεί την πρωτεΐνη-υποδοχέα μέσω της οποίας ο ιός SARS-CoV-2 προσδένεται και εισέρχεται στα κύτταρα, καθώς και λαμβάνοντας υπόψη δεδομένα που υποδεικνύουν αλληλεπίδραση ιικών πρωτεϊνών με τη μονοαμινοξειδάση Α (MAO-A) και τη συμμετοχή της κατεχολ-Ο-μεθυλοτρανσφεράσης (COMT) στη διαδικασία της λοίμωξης, εξετάστηκε για πρώτη φορά η συσχέτιση της DDC με τη λοίμωξη από τον SARS-CoV-2, τόσο σε καλλιεργούμενα επιθηλιακά κύτταρα όσο και σε κλινικά δείγματα ασθενών. Σύνοψη αποτελεσμάτων και συμπεράσματα: Τα πειραματικά αποτελέσματα που προέκυψαν στο πλαίσιο της παρούσας Διδακτορικής διατριβής απέδωσαν την αρνητική επίδραση της λοίμωξης από τους ιούς HCV και DENV στα επίπεδα έκφρασης της L-Dopa αποκαρβοξυλάσης (DDC) στη δράση των παραγόντων που επάγονται από την υποξία (HIFs). Το εν λόγω συμπέρασμα τεκμηριώθηκε μέσω της παρατήρησης ότι η παρουσία αναστολέα των HIFs εξασθένισε τη μειωτική επίδραση της ιογενούς λοίμωξης στα πρωτεϊνικά επίπεδα της DDC. Επιπλέον, αναδείχθηκε η κρίσιμη σημασία της βιοσυνθετικής λειτουργίας της L-Dopa αποκαρβοξυλάσης (DDC) στον περιορισμό των λοιμώξεων από τους προαναφερθέντες ιούς. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε ενίσχυση της ιικής αντιγραφής σε κυτταρικά συστήματα όπου πραγματοποιήθηκε σίγηση της έκφρασης του γονιδίου DDC, εύρημα το οποίο συνοδεύτηκε από εξασθένιση της ανασταλτικής επίδρασης των υποστρωμάτων του ενζύμου, L-Dopa και 5-υδροξυτρυπτοφάνης (5-HTP), στον ιικό πολλαπλασιασμό, στα ίδια κύτταρα. Παράλληλα, η εξωγενής χορήγηση ντοπαμίνης οδήγησε σε σημαντική καταστολή του ιικού πολλαπλασιασμού, αποτέλεσμα το οποίο αποδείχθηκε ανεξάρτητο από τη σηματοδοσία μέσω των υποδοχέων D2 της ντοπαμίνης. Αξίζει να σημειωθεί ότι η χημική αναστολή της λειτουργίας των μεταφορέων της ντοπαμίνης οδήγησε σε αύξηση της αντιγραφής και για τους δύο ιούς, γεγονός που αποδόθηκε στη μειωμένη πρόσληψη του μορίου από το εξωκυτταρικό περιβάλλον. Επιπλέον, στην περίπτωση του ιού HCV διαπιστώθηκε ότι η ντοπαμίνη ασκεί την αντι-ιική της δράση μέσω ρύθμισης των ενδοκυτταρικών επιπέδων ελευθέρων ριζών οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS). Συγκεκριμένα, η παράλληλη χορήγηση ντοπαμίνης και ανηγμένης γλουταθειόνης, ενός ευρέως χρησιμοποιούμενου αντιοξειδωτικού παράγοντα, εξουδετέρωσε τη μείωση του ιικού πολλαπλασιασμού. Αντίθετα, στην περίπτωση της λοίμωξης από τον ιό DENV, παρότι επιβεβαιώθηκε η σημασία της ενδοκυττάριας συσσώρευσης της ντοπαμίνης, η αντι-ιική επίδραση του μορίου αποδείχθηκε ανεξάρτητη από τη ρύθμιση της παραγωγής ελευθέρων ριζών οξυγόνου (ROS).Η συσχέτιση της λοίμωξης από τον ιό SARS-CoV-2 με την έκφραση της L-Dopa αποκαρβοξυλάσης (DDC), καθώς και ευρύτερα με τη λειτουργία του βιοσυνθετικού και μεταβολικού μονοπατιού των κατεχολαμινών, διερευνήθηκε τόσο σε κλινικά δείγματα ασθενών όσο και σε καλλιεργούμενα κυτταρικά πρότυπα. Ειδικότερα, σε ασθενείς που παρουσίαζαν ήπια ή ασυμπτωματική μορφή της νόσου COVID-19, καταγράφηκε αυξημένη έκφραση της DDC σε σύγκριση με την ομάδα αρνητικού ελέγχου, ενώ παράλληλα διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων της DDC και του ιικού RNA. Επιπροσθέτως, παρατηρήθηκαν υψηλά επίπεδα συσχέτισης μεταξύ της έκφρασης της DDC και του γονιδίου dACE2, μιας ισομορφής του υποδοχέα ACE2, η οποία επάγεται από την ιντερφερόνη. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει πιθανή εμπλοκή της DDC σε μια ενορχηστρωμένη αντι-ιική ανοσιακή απόκριση του κυτταρικού ξενιστή. Αντίθετα, στους ασθενείς που παρουσίασαν σοβαρή κλινική εικόνα της νόσου COVID-19 παρατηρήθηκε σημαντική καταστολή της έκφρασης της L-Dopa αποκαρβοξυλάσης (DDC), με τα επίπεδα της να είναι χαμηλότερα ακόμη και σε σύγκριση με εκείνα της ομάδας αρνητικού ελέγχου. Τα εν λόγω ευρήματα αναδεικνύουν, για πρώτη φορά, τη DDC ως έναν αξιόπιστο μοριακό βιοδείκτη πρόγνωσης της σοβαρότητας της νόσου COVID-19. Επιπροσθέτως, στα δείγματα των ασθενών με σοβαρή νόσο ανιχνεύθηκε εκτεταμένη τροποποίηση στη βιοσύνθεση και τον μεταβολισμό της ντοπαμίνης, η οποία περιλαμβάνει μείωση της έκφρασης της DDC και ταυτόχρονη αύξηση των επιπέδων mRNA των ενζύμων μονοαμινοξειδάσης A και B (MAO-A και MAO-B), που εμπλέκονται στον καταβολισμό της ντοπαμίνης. Τα δεδομένα αυτά υπογραμμίζουν τη σημασία της ντοπαμίνης ως πιθανό ρυθμιστικό παράγοντα της ιογενούς λοίμωξης. Τα ανωτέρω ευρήματα επιβεβαιώθηκαν και σε μολυσμένα επιθηλιακά κύτταρα VeroE6, τα οποία προέρχονται από το νεφρό ενήλικου αφρικανικού πράσινου πιθήκου (Chlorocebus sabaeus). Επιπλέον, όπως είχε ήδη παρατηρηθεί για τους ιούς HCV και DENV, η εξωγενής χορήγηση μη κυτταροτοξικών συγκεντρώσεων ντοπαμίνης ή L-Dopa στα ίδια κυτταρικά συστήματα οδήγησε σε σημαντική μείωση της εξάπλωσης του ιού SARS-CoV-2, όπως αποδεικνύεται από τη μείωση των επιπέδων της ιογενούς επαγόμενης κυτταροπαθογόνου δράσης. Η χορήγηση L-Dopa ή ντοπαμίνης θα μπορούσε να αποτελέσει μία δυνητική αντι-ιική στρατηγική, ιδιαίτερα σε ασθενείς με ανοσοκαταστολή, η οποία έχει συσχετιστεί με αυξημένα ιικά φορτία SARS-CoV-2. Τέλος, το σύνολο των αποτελεσμάτων της παρούσας διδακτορικής διατριβής καταδεικνύουν την άμεση σχέση νευρομορίων με τις ιογενείς λοιμώξεις.