Investigating the intracellular molecular mechanisms of Parkinson's disease

Abstract

Mutations in the leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) are the leading cause of genetically inherited Parkinson΄s disease (PD). Two of the common found mutations namely R1441C and G2019S, mediate their toxic effects through their increased kinase activity. Furthermore, the kinase activity of LRRK2 is regulated through some essential serine and threonine autophosphorylation residues that are located in the LRR, ROC and kinase domains. In this study we identified Protein Phosphatase 2A (PP2A), as an interacting partner of LRRK2. Additionally we were able to demonstrate that only the ROC domain is needed to interact with the three subunits of PP2A in SH-SY5Y cells and in Hela cells. We have shown that the alpha subunit of PP2A (PP2Aa) is interacting with LRRK2 in the perinuclear region of Hela cells. We also investigated the physiological role of PP2A in SH-SY5Y cells transiently expressing R1441C-LRRK2, by silencing the catalytic subunit of PP2A (PP2Ac). As a result, cell death which was induced by R1441C-LRRK2 was significantly aggravated. Finally, pharmacological activation of PP2A by sodium selenate in SH-SY5Y in cells transiently transfected with R1441C-LRRK2, showed a partial neuroprotection from the mutation. All these data suggest that PP2A is a new interacting partner of LRRK2 and reveal the importance of PP2A as a potential therapeutic target in PD. The second part of my PhD Thesis focuses in VDAC-1, which is a protein also correlated with PD mitochondrial induced cell death. Initially we found that the ROC domain of LRRK2 is the domain, through which the interaction with LRRK2 takes place. When comparing the binding of the ROC-WT to the VDAC versus the ROC-R1441C, we noticed that the ROC-WT protein binds in a much bigger extent to the total VDAC levels, compared to the ROC-R1441C protein. Additionally, using reductase assays, plasma membrane VDAC-1 seems to be accountable for the majority of the reductase activity in HEK293T cells. After expressing ROC-WT or R1441C proteins in HEK293T cells, the total reductase activity levels in ROC-WT transfected HEK293T cells was reduced, compared to ROC-R1441C transfected cells. These data suggest that the ROC/LRRK2 protein could possibly bind the plasma membrane-VDAC-1 as a chaperone and reduce its reductase enzyme properties. On the other hand, in the presence of R1441C mutation, ROC-R1441C cannot bind plasma membrane VDAC-1 so efficiently and this leads to elevated reductase activity levels of plasma membrane VDAC-1.

Οι μεταλλάξεις της LRRK2 (Leucine rich repeat kinase) κινάσης αποτελούν την κύρια αιτία της κληρονομικής νόσου του Πάρκινσον (PD). Δύο από τις πιο συχνές μεταλλάξεις της LRRK2, η R1441Cκαι η G2019S, συνεισφέρουν στην παθολογία της νόσου μέσω της αυξημένης ενζυματικής δραστηριότητας τους (αυξημένα επίπεδα κινάσης). Επιπλέον, τα επίπεδα κινάσης της LRRK2 ρυθμίζονται μέσω αυτοφωσφορυλίωσης της σε αμινοξέα σερίνης και θρεονίνης που βρίσκονται στις περιοχές LRR, ROC και κινάσης. Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε την Πρωτεϊνική Φωσφατάση 2Α (PP2A), ως αλληλεπιδρώντα εταίρο της LRRK2. Επιπλέον, καταφέραμε να δείξουμε ότι μόνο η υπομονάδα ROC είναι απαραίτητη για να αλληλεπιδράσει με τις τρεις υπομονάδες της PP2A στα κύτταρα SH-SY5Y και στα κύτταρα Hela. Αποδείξαμε ότι η υπομονάδα άλφα της PP2A (PP2Aa) αλληλεπιδρά με την LRRK2 στην περιπυρηνική περιοχή των κυττάρων Hela. Διερευνήσαμε επίσης τον φυσιολογικό ρόλο της PP2A σε κύτταρα SH-SY5Y που εκφράζουν την πρωτεΐνη R1441C-LRRK2, μέσω της σίγησης (silencing) της καταλυτικής υπομονάδας της PP2A (PP2Ac). Ως αποτέλεσμα, ο κυτταρικός θάνατος που προκλήθηκε από την R1441C-LRRK2 επιδεινώθηκε σημαντικά. Τέλος, η φαρμακολογική ενζυματική ενεργοποίηση της PP2A σε κύτταρα που εξέφραζαν την παρκινσονική μετάλλαξη R1441C-LRRK2 , είχε ως αποτέλεσμα μερική νευροπροστασία από τη μετάλλαξη. Όλα αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η PP2A είναι ένας νέος αλληλεπιδρών εταίρος της LRRK2 και αποκαλύπτουν τη σημασία της PP2A ως πιθανό θεραπευτικό στόχο στην νόσο του Πάρκινσον. Το δεύτερο μέρος της διδακτορικής μου διατριβής επικεντρώνεται στην VDAC-1, η οποία είναι μια πρωτεΐνη που συσχετίζεται επίσης με τον μιτοχονδριακό κυτταρικό θάνατο που προκαλείται κατά την εξέλιξη της νόσου του Πάρκινσον. Αρχικά διαπιστώσαμε ότι η περιοχή ROC της LRRK2 είναι η περιοχή, μέσω της οποίας λαμβάνει χώρα η αλληλεπίδραση με την VDAC. Συγκρίνοντας ποσοτικά τα επίπεδα αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης ROC-WT με την πρωτεΐνη VDAC έναντι της πρωτεΐνης ROC-R1441C, παρατηρήσαμε ότι η πρωτεΐνη ROC-WT συνδέεται σε πολύ μεγαλύτερο βαθμό σε σχέση μετα συνολικά επίπεδα VDAC, σε σύγκριση με την πρωτεΐνη ROC-R1441C. Tα επίπεδα αναγωγάσης στα κύτταρα είναι ένας σημαντικός παράγοντας για την παθολογία της νόσου της Πάρκινσον. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας δοκιμασίες/τεχνικές αναγωγάσης (reductase assays), η πρωτεΐνη VDAC-1, η οποία συναντάται στην πλασματική μεμβράνη των κύτταρων φαίνεται να ευθύνεται για το μεγαλύτερο μέρος της δραστικότητας των συνολικών επιπέδων αναγωγάσης στα κύτταρα HEK293T. Μετά την έκφραση πρωτεϊνών ROC-WT ή R1441C σε κύτταρα HEK293T, τα συνολικά επίπεδα δραστικότητας αναγωγάσης σε κύτταρα HEK293T που είχαν επιμολυνθεί με την ROC-WT μειώθηκαν, σε σύγκριση μετα κύτταρα που είχαν επιμολυνθεί με την ROC-R1441C. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η πρωτεΐνη ROC/LRRK2 θα μπορούσε ενδεχομένως να συνδεθεί με την πρωτεΐνη VDAC-1 της πλασματικής μεμβράνης ως συνοδό και να μειώσει τις ιδιότητες του ενζύμου αναγωγάσης της VDAC-1. Από την άλλη πλευρά, παρουσία της μετάλλαξης R1441C, η πρωτεΐνη ROC-R1441C δεν μπορεί να συνδεθεί τόσο αποτελεσματικά με την VDAC-1 της πλασματικής μεμβράνης και αυτό ως αποτέλεσμα αυξημένα επίπεδα δραστικότητας αναγωγάσης του VDAC-1 της πλασματικής μεμβράνης. Επομένως μεταλλάξεις στην LRRK2 όπως η ROC- R1441C φαίνεται να συνεισφέρουν στην παθολογία της νόσου του Πάρκινσον μέσω μειωμένης αλληλεπίδρασής τους με την πρωτεΐνη VDAC-1.