Παραγωγή και έλεγχος βιοδραστικότητας ανασυνδυασμένων πολυπεπτιδίων με φαρμακευτική δράση

Abstract

In this study three polypeptide biopharmaceuticals with increasing research and economic interest were investigated: Interleukin-2 (IL-2), Erythropoietin (Epo) and Interferon alpha 2a (IFNα2a). Specifically, in cancer immunotherapy clinical approaches IL-2 is used as an anticancer agent to treat melanoma and metastatic kidney cancer, while Εpo is administered to patients with severe chronic kidney diseases, HIV and cancer patients receiving chemotherapy or to treat anemia. IFNα2a has been approved for the treatment of hairy cell leukemia, chronic hepatitis B and C virus infection (HBV & HCV), chronic myeloid leukemia (CML), renal cell carcinoma, Kaposi’s sarcoma, T-cell lymphoma, multiple myeloma and condyloma acuminata. Currently, these polypeptide drugs are expressed and purified as recombinant proteins in bacteria (in case of Epo, mammalian cells) and are available as injectable lyophilized powder. We used state-of-the-art protein expression technology in yeast cell systems and the 3 polypeptide drugs were formulated in various pharmaceutical forms aiming to improve the drug release kinetics (biobetters). First, we cloned the synthetic genes encoding the human mature IL-2, Epo and IFNα2a using the P. pastoris codon bias in specific vectors with removable affinity tags. The purification of the secreted tagged proteins was conducted with affinity chromatography. We managed to isolate recombinant IL-2 and IFNα2a. Free from the tags, the human mature IL-2 and IFNα2a were collected after treatment with TEV protease, followed by a second cycle of affinity chromatography. We further investigated the potential immunogenicity of these recombinant proteins at a preclinical level. A three-prong approach was followed. First, we performed an extensive in silico analysis using databases, such as the Immune Epitope Database (IEDB) and SYFPEITHI, in order to predict interactions with common HLA epitopes. The findings of the in silico studies were then experimentally confirmed by immunoassays, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, we conducted a comparative in vitro study of the immunogenicity of the 2 polypeptides in peripheral monocytes (PBMCs) from healthy donors. More specifically, we examined the stimulation of T-cells, as monitored after CFSE labeling and FACS analysis, as well as the levels of cytokine secretion (IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-10). Using state-of-the art technology, our polypeptide was used to develop new pharmaceutical forms: hydrogels and PLGA microspheres. Hydrogels turned out to be a more effective pharmaceutical form. The structural stability and right folding of the mature polypeptides as well as their pharmaceutical forms were also confirmed with circular dichroism and DSF (Differential Scanning Fluorimetry). Then, the biological activity of the recombinant IFNα2a and IL-2 and their pharmaceutical forms was assessed and compared to that of the corresponding prescribed as medication drugs. Real-time PCR revealed that IFNα2a produced by Pichia pastoris, induced the up-regulation of various interferon stimulated genes (ISGs) such as MX1, OAS1, IFIT1, IFIT3 and TRAIL in A549 and HT29 cell lines. In case of IL-2, our results showed a mild increase in the transcriptional levels of the Cyclin D2, Bcl-2, FASLG, IL2RA, SOCS-2 and TNFα genes, but at the same levels as commercially available IL-2. Finally, bioavailability and pharmacokinetics were evaluated in vivo in mice, indicating higher bioavailability of the hydrogel pharmaceutical form.

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν τρία πολυπεπτιδικά βιοφάρμακα με ιδιαίτερο ερευνητικό και οικονομικό ενδιαφέρον: η Ιντερλευκίνη-2, η Ερυθροποιητίνη και η Ιντερφερόνη άλφα 2α. Η ιντερλευκίνη-2 (IL-2) σε συνδυασμό με άλλες φαρμακευτικές ουσίες χορηγείται σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα. Η ιντερφερόνη άλφα 2α (IFNα2a) χορηγείται για την αντιμετώπιση ασθενειών όπως το AIDS, οι Hπατίτιδες Β και C, καθώς και σε ορισμένες μορφές κακοήθων όγκων. Η ερυθροποιητίνη (Εpo) χρησιμοποιείται κυρίως σε ασθενείς με αναιμία, σε άτομα με σοβαρές χρόνιες νεφρικές παθήσεις καθώς επίσης και σε καρκινοπαθείς οι οποίοι λαμβάνουν χημειοθεραπεία. Σήμερα, τα συγκεκριμένα πολυπεπτιδικά φάρμακα παράγονται ως ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες από βακτήρια (κύτταρα θηλαστικών στην περίπτωση της ερυθροποιητίνης) και χορηγούνται σε ενέσιμη μορφή. Υπερβαίνοντας την πρακτική αυτή, στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε το ευκαρυωτικό σύστημα έκφρασης του μεθυλότροφου μύκητα Pichia pastoris για την παραγωγή των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Στόχος της μελέτης ήταν η ανάπτυξη τριών βιοϊσοδύναμων πολυπεπτιδικών φαρμάκων με ενισχυμένα χαρακτηριστικά, δηλαδή «βιοκαλύτερων» θεραπευτικών μορίων. Για να επιτευχθεί αυτό, αρχικά έγινε η κατασκευή και ο μοριακός έλεγχος των ανασυνδυασμένων φορέων έκφρασης για τις τρεις πρωτεΐνες. Ακολούθησε επαγωγή της έκφρασης και τελικά επιτεύχθηκε η απομόνωση και ο καθαρισμός των ανασυνδυασμένων IL-2 και IFNα2a με χρωματογραφία συγγένειας. Για την αξιολόγηση της ανοσογονικότητας των φαρμακευτικών πολυπεπτιδίων σε προ-κλινικό επίπεδο, πραγματοποιήθηκε αρχικά in silico βιοπληροφορική πρόβλεψη πιθανών ανοσολογικών επιτόπων. Έπειτα εξετάστηκε η αντιγονικότητα των νέων ανασυνδυασμένων IFNα2a και IL-2 με ανοσοδοκιμασία ELISA. Παράλληλα πραγματοποιήθηκε in vitro μελέτη της ανoσογονικότητας των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών εστιάζοντας σε CD3+ Τ-λεμφοκύτταρα που απομονώθηκαν από περιφερικό αίμα υγιών φυσιολογικών δοτών. Τα αποτελέσματα έδειξαν παρόμοια και χαμηλά επίπεδα κυτταρικής διέγερσης και έκκρισης κυτταροκινών μετά από επίδραση με τις νέες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, γεγονός που υποδηλώνει απουσία έντονης μη ειδικής ανοσολογικής ενεργοποίησης. Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν οι φαρμακομορφές της IFNα2a και IL-2 σε διάλυμα χιτοζάνης/β-φωσφορικής γλυκερόλης (υδρογέλη) καθώς και σε μορφή μικροσφαιριδίων. Και οι δύο φαρμακομορφές αναπτύχθηκαν επιτυχώς, ωστόσο η αποδέσμευση των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών επιτεύχθηκε μόνο με τη φαρμακομορφή της γέλης και όχι από τα μικροσφαιρίδια. Έπειτα ακολούθησε ο δομικός χαρακτηρισμός των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών μέσω φασματοσκοπίας κυκλικού διχρωισμού (CD), όπου διαπιστώθηκε ότι τα πολυπεπτίδια εμφανίζουν στοιχεία δευτεροταγούς δομής συμβατά με τη φυσιολογική αναδίπλωσή τους στο χώρο. Παράλληλα αξιολογήθηκε και η δομική σταθερότητα των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών με την τεχνική της Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης (DSF). Για την εκτίμηση της βιολογικής δραστικότητας των νέων ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και των φαρμακομορφών τους πραγματοποιήθηκαν επιδράσεις σε κυτταρικές σειρές που εκφράζουν τους αντίστοιχους υποδοχείς. Στην περίπτωση της IFΝα2a χρησιμοποιήθηκαν οι κυτταρικές σειρές: Α549 και HT29. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι η νέα ανασυνδυασμένη IFNα2a , (και η φαρμακομορφή της) είναι βιολογικά δραστικές, καθώς προκάλεσαν δοσοεξαρτώμενη αύξηση των μεταγραφικών επιπέδων των γονιδίων TRAIL, MX1, IFIT1, OAS2, HERC5, IFIT3 και στις δύο κυτταρικές σειρές. Στην περίπτωση της IL-2 χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά Jurkat, όπου παρατηρήθηκε ήπια αύξηση των μεταγραφικών επιπέδων των γονιδίων Cyclin D2, Bcl-2, FASLG, IL2RA, SOCS-2 και TNFα, σε επίπεδα συγκρίσιμα με εκείνα της εμπορικά διαθέσιμης IL-2. Τέλος μελετήθηκε η βιοδιαθεσιμότητα των νέων φαρμακομορφών in vivo σε πειραματόζωα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η φαρμακομορφή της γέλης αποτελεί μια υποσχόμενη στρατηγική για τη βελτίωση της αρχικής βιοδιαθεσιμότητας της IFNα2α και της IL-2.