A study of genetic mechanisms and metabolic pathways which are implicated in fungal endophytism and entomopathogenicity by fungi belonging to the order Hypocreales

Abstract

Entomopathogenic fungi (EPF) are natural pathogens of insects. Different strains and species exhibit morphological, ecological, and phylogenetic variation and can infect a wide range of insect hosts in diverse environmental habitats. For this reason, many strains have been developed as biological control agents (BCAs) and are being used in agriculture. The order Hypocreales is one of the most diverse fungal orders and its members have undergone multiple host shifts throughout evolution, forming relationships with insects, plants, and other organisms, which can be either beneficial or pathogenic. The order has two main entomopathogenic families, Clavicipitaceae and Cordycipitaceae, containing, among others, two of the most prevalent entomopathogenic genera, Metarhizium and Beauveria. These species are also capable of associating with plants as endophytes or rhizosphere colonizers, offering multiple benefits by promoting plant growth, enhancing resistance to pests and pathogens, and increasing tolerance to environmental stress. Despite growing evidence supporting this ecological versatility, the mechanisms underlying this dual mode of life remain poorly understood. By comparison, entomopathogenicity is more thoroughly investigated. However, there are several questions regarding the determinants of observed differences in efficacy between closely related strains within a species, as well as the genetic factors that shape host range. In addition, there are emerging questions on how these fungi are able to interact with plants without causing disease, and what molecular mechanisms they employ to support this ecological versatility. In this context, this thesis aimed to investigate the genomic and metabolic basis of lifestyle plasticity in EPF, using the genera Metarhizium and Beauveria as model organisms. The first part of this thesis focused on genomic analyses of several EPF species and strains. In this context, in the second chapter of this thesis, the contribution of the mitochondrial genome to the phylogeny and identification of Metarhizium species and strains was evaluated to characterize seven newly isolated strains showing promise as biological control agents (BCAs). Phylogenetic trees based on the concatenation of mitochondrial domains and the nuclear ITS1-5.8S-ITS2 region showed clear discrimination among species and allowed the identification of uncharacterized strains. In the third chapter of this thesis, a sequencing, assembly, and annotation pipeline was developed to generate new EPF genome sequences using Nanopore technology and to apply comparative genomics across different datasets to examine how genetic differences drive differentiation in these fungi. In the fourth chapter, whole-genome sequencing with Nanopore technology and an intraspecies comparative genomic analysis were performed between two important biocontrol strains of Metarhizium brunneum (V275 and ARSEF 4556) that exhibited differences in biological performance. The results showed substantial genomic variability even at the intraspecies level. Important differences were detected in secondary metabolism, as well as in the presence of strain-specific genes. Transposable element expansion and secondary metabolism differentiation were identified as the most probable drivers of this differentiation. In a fifth chapter, the same whole-genome sequencing and comparative genomics approach was followed to compare two known EPF species with different insect host ranges, i.e., the generalist Beauveria bassiana and the specialist Beauveria brongniartii, in order to investigate the mechanisms behind host range divergence. Results showed that core functional repertoires associated with substrate breakdown, such as carbohydrate-active enzymes, which are part of the primary metabolism, were largely conserved between the two species, reflecting a shared fungal lifestyle. In contrast, secondary metabolism showed substantial differentiation, with changes in key virulence-related biosynthetic gene clusters between the two species. This supports the idea that this diversification is a key driver of host range divergence and specialization. Moreover, the detection of candidate effector-like proteins that present similarities with plant pathogens suggests that EPF may use molecular strategies similar to those of other plant-associated fungi to avoid host responses and establish asymptomatic colonization. Given the rich secondary metabolite diversity of both Metarhizium and Beauveria species, the second major aim of this thesis focused on investigating the biological activity of two Metarhizium-derived volatile organic compounds, 1-octen-3-ol and 3-octanone. In chapter six, assessment of their activity on various important crops showed that these volatiles can stimulate plant growth independently of the producing fungi. In the seventh chapter, these results were also validated in a wireworm-infested potato field, where the two compounds showed high efficacy in both plant growth promotion and pest deterrence. Moreover, in a separate set of assays and as part of chapter eight, both compounds showed the potential to significantly reduce nematodes of the genus Meloidogyne, both in vitro and in greenhouse assays, affecting multiple nematode life stages. All these results highlight the potential of fungal VOCs for applications in sustainable agriculture. Finally, based on the extensive genomic variability observed at both intra- and inter-species levels, this work expanded the genomic dataset in chapter nine, to include 50 additional Hypocrealean strains. These included strains of several key Hypocrealean families with different lifestyles and provided a valuable dataset for future large-scale comparative genomic studies to gain insights into the mechanisms associated with each lifestyle and the evolutionary trajectories that shaped them. Besides the extensive comparative genomic approaches, additional omics methods were employed to study plant host-EPF interactions. Two endophytic EPF strains, Metarhizium brunneum V275 and Beauveria brongniartii BIPESCO2, were inoculated in tomato plants (Solanum lycopersicum). Moreover, in an additional experiment, the phytopathogenic fungus Verticillium dahliae was co-inoculated with these fungi. Transcriptomic and metabolomic analyses of over 300 samples collected over a two-month period will help identify the molecular mechanisms and metabolic processes that are activated during early and late stages of colonization by EPF. Finally, in chapter ten, proteomic analysis of selected samples showed changes in the in planta production of fungal proteins, whereas the plant host proteome remained unchanged. Overall, this thesis provides new insights into the genetic mechanisms that underlie endophytism and entomopathogenicity of EPF belonging to the Metarhizium and Beauveria genera. This thesis demonstrates that while primary metabolic functions are largely conserved across EPF, diversification of secondary metabolism is a major driver of ecological specialization, host range differentiation, and functional versatility. By combining comparative genomics with functional assays and multi-omics approaches, this work advances our understanding of the evolutionary and mechanistic basis of EPF lifestyles and highlights their considerable potential for application in sustainable pest management and green agriculture.

Οι εντομοπαθογόνοι μύκητες αντιπροσωπεύουν είδη που είναι φυσικά παθογόνα των εντόμων. Αυτά τα στελέχη παρουσιάζουν μορφολογική, οικολογική και φυλογενετική ποικιλομορφία και μπορούν να μολύνουν ένα ευρύ φάσμα εντόμων-ξενιστών σε ποικίλα περιβαλλοντικά ενδιαιτήματα. Για το λόγο αυτό, πολλά στελέχη έχουν αναπτυχθεί ως παράγοντες βιολογικού ελέγχου και χρησιμοποιούνται στη γεωργία. Η τάξη Hypocreales είναι μια από τις πιο πολυπληθείς μυκητιακές τάξεις και τα μέλη της έχουν υποστεί πολλαπλές αλλαγές ξενιστών καθ' όλη τη διάρκεια της εξέλιξης, δημιουργώντας αλληλεπιδράσεις-σχέσεις με έντομα, φυτά και άλλους οργανισμούς, οι οποίες μπορεί να είναι είτε ωφέλιμες είτε παθογόνες. Η τάξη έχει, μεταξύ άλλων, δύο κύριες εντομοπαθογόνες οικογένειες, τις Clavicipitaceae και Cordycipitaceae, που περιέχουν δύο από τα πιο διαδεδομένα εντομοπαθογόνα γένη, Metarhizium και Beauveria. Αυτά τα είδη είναι επίσης ικανά να συνδέονται με φυτά ως ενδόφυτα ή αποικιστές της ριζόσφαιράς τους, προσφέροντας πολλαπλά οφέλη μέσω της προώθησης της ανάπτυξης των φυτών, της ενίσχυσης της αντοχής σε παράσιτα και παθογόνα και μέσω της αύξησης την αντοχής στο περιβαλλοντικό στρες. Παρά τα αυξανόμενα στοιχεία που περιγράφουν και επικυρώνουν αυτήν την οικολογική ευελιξία, οι μηχανισμοί που διέπουν αυτόν τον διπλό τρόπο ζωής παραμένουν ελάχιστα κατανοητοί. Συγκριτικά, η εντομοπαθογένεια έχει διερευνηθεί διεξοδικότερα. Ωστόσο, υπάρχουν αρκετά ερωτήματα σχετικά με τους παράγοντες που καθορίζουν τις παρατηρούμενες διαφορές στην αποτελεσματικότητα μεταξύ στενά συγγενικών στελεχών εντός του είδους ή τους γενετικούς παράγοντες που διαμορφώνουν το εύρος των ξενιστών τους. Επιπλέον, ανακύπτουν ερωτήματα σχετικά με το πώς αυτοί οι μύκητες είναι σε θέση να αλληλεπιδρούν με τα φυτά χωρίς να προκαλούν ασθένειες και ποιους μοριακούς μηχανισμούς χρησιμοποιούν για να υποστηρίξουν αυτήν την οικολογική ευελιξία. Σε αυτό το πλαίσιο, η παρούσα διατριβή είχε ως στόχο να διερευνήσει τη γονιδιωματική και μεταβολική βάση της πλαστικότητας του τρόπου ζωής στον εντομοπαθογόνων μυκήτων, χρησιμοποιώντας τα γένη Metarhizium και Beauveria ως οργανισμούς-μοντέλα. Το πρώτο μέρος της διατριβής επικεντρώθηκε στις γονιδιωματικές μελέτες διάφορων στελεχών και ειδών εντομοπαθογόνων μυκήτων. Υπό αυτό το πλαίσιο, στο δεύτερο κεφάλαιο της διατριβής, αξιολογήθηκε η συμβολή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος στη φυλογένεση και την ταυτοποίηση ειδών και στελεχών Metarhizium, για να χαρακτηριστούν επτά πρόσφατα απομονωμένα στελέχη που παρουσιάζουν προοπτικές για χρήση ως παράγοντες βιολογικού ελέγχου. Φυλογενετικά δέντρα που βασίζονται στη συνένωση μιτοχονδριακών περιοχών και της πυρηνικής περιοχής ITS1-5.8S-ITS2 έδειξαν διάκριση των στελεχών που μελετήθηκαν και επέτρεψαν την αναγνώριση μη χαρακτηρισμένων στελεχών. Στο τρίτο κεφάλαιο της παρούσας διατριβής, αναπτύχθηκε ένα πρωτόκολλο αλληλούχισης, συναρμολόγησης και επισημείωσης γονιδιωμάτων, με σκοπό την παραγωγή γονιδιωματικών αλληλουχιών EPF μέσω τεχνολογίας Nanopore και την εφαρμογή συγκριτικής γονιδιωματικής σε διαφορετικά σύνολα δεδομένων, ώστε να διερευνηθεί πώς οι γενετικές διαφορές οδηγούν σε διαφοροποίηση αυτών των μυκήτων. Στο τέταρτο κεφάλαιο, πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση ολόκληρων των γονιδιωμάτων και ενδοειδική συγκριτική γονιδιωματική ανάλυση μεταξύ δύο σημαντικών στελεχών βιολογικού ελέγχου του Metarhizium brunneum (V275 και ARSEF 4556), τα οποία παρουσίαζαν διαφορές στη βιολογική τους απόδοση. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική γονιδιωματική μεταβλητότητα ακόμη και σε ενδοειδικό επίπεδο. Σημαντικές διαφορές ανιχνεύθηκαν στον δευτερογενή μεταβολισμό, καθώς και στην παρουσία γονιδίων ειδικών για το κάθε στέλεχος. Η ποσοτική και ποιοτική επέκταση και η διαφοροποίηση των μεταθετών στοιχείων προσδιορίστηκαν ως η πιο πιθανή αιτία αυτής της διαφοροποίησης. Στο πέμπτο κεφάλαιο, ακολουθήθηκε η ίδια προσέγγιση αλληλούχισης ολόκληρου του γονιδιώματος και συγκριτικής γονιδιωματικής, για να συγκριθούν δύο γνωστά είδη εντομοπαθογόνων μυκήτων με διαφορετικά εύρη ξενιστών εντόμων, δηλαδή του είδους με ευρύ φάσμα ξενιστών Beauveria bassiana και του είδους με στενό φάσμα ξενιστών Beauveria brongniartii, προκειμένου να διερευνηθούν οι μηχανισμοί πίσω από την απόκλιση του εύρους αυτού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι βασικές λειτουργικές ομάδες που σχετίζονται με την αποικοδόμηση του υποστρώματος, όπως τα ένζυμα που δρουν στους υδατάνθρακες, τα οποία αποτελούν μέρος του πρωτογενούς μεταβολισμού, διατηρήθηκαν σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των δύο ειδών, αντανακλώντας έναν κοινό μυκητιακό τρόπο ζωής. Αντίθετα, ο δευτερογενής μεταβολισμός έδειξε σημαντική διαφοροποίηση, με αλλαγές σε βασικές συστάδες βιοσυνθετικών γονιδίων που σχετίζονται με τη μολυσματική δράση των δύο ειδών. Αυτό υποστηρίζει την ιδέα ότι αυτή η διαφοροποίηση είναι πιθανώς ένας βασικός παράγοντας απόκλισης και εξειδίκευσης του εύρους των ξενιστών. Επιπλέον, η ανίχνευση υποψήφιων πρωτεϊνών που μοιάζουν με τελεστές (effectors) και παρουσιάζουν ομοιότητες με αυτούς σε φυτοπαθογόνους οργανισμούς, υποδηλώνει ότι οι εντομοπαθογόνοι μύκητες μπορούν να χρησιμοποιούν μοριακές στρατηγικές παρόμοιες με εκείνες άλλων μυκήτων που σχετίζονται με τα φυτά, για να αποφύγουν τις αντιδράσεις του ξενιστή και να δημιουργήσουν ασυμπτωματικό αποικισμό. Δεδομένης της πλούσιας ποικιλομορφίας δευτερογενών μεταβολιτών τόσο των ειδών Metarhizium όσο και των ειδών Beauveria, ο δεύτερος κύριος στόχος αυτής της διατριβής επικεντρώθηκε στη διερεύνηση της βιολογικής δράσης δύο πτητικών οργανικών ενώσεων που προέρχονται από το Metarhizium, της 1-οκτεν-3-όλης και της 3-οκτανόνης. Στο κεφάλαιο έξι, η αξιολόγηση της δράσης τους σε διάφορες σημαντικές καλλιέργειες έδειξε ότι αυτές οι πτητικές ουσίες ήταν σε θέση να διεγείρουν την ανάπτυξη των φυτών ανεξάρτητα από τους μύκητες που τις παράγουν. Στο κεφάλαιο επτά, αυτά τα αποτελέσματα επικυρώθηκαν επίσης σε ένα χωράφι καλλιέργειας πατάτας μολυσμένο με σιδηροσκώληκες (wireworms), όπου οι δύο ενώσεις έδειξαν υψηλή αποτελεσματικότητα τόσο στην προώθηση της ανάπτυξης των φυτών όσο και στην αποτροπή των παρασίτων. Επιπλέον, σε ξεχωριστό σύνολο δοκιμών και ως μέρος του κεφαλαίου οκτώ, και οι δύο ενώσεις έδειξαν τη δυνατότητα να μειώσουν σημαντικά τους νηματώδεις του γένους Meloidogyne, τόσο in vitro όσο και σε δοκιμές θερμοκηπίου, επηρεάζοντας πολλαπλά στάδια της ζωής νηματωδών. Όλα αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν τις δυνατότητες των μυκητιακών πτητικών οργανικών ενώσεων για εφαρμογές στη βιώσιμη γεωργία. Τέλος, με βάση την εκτεταμένη γονιδιωματική μεταβλητότητα που παρατηρήθηκε τόσο σε ενδο- όσο και σε δια-ειδικό επίπεδο, η παρούσα εργασία επέκτεινε το γονιδιωματικό σύνολο δεδομένων, στο κεφάλαιο εννέα, ώστε να συμπεριλάβει 50 επιπλέον στελέχη της τάξης Hypocreales. Αυτά περιλάμβαναν στελέχη αρκετών βασικών οικογενειών της τάξης Hypocreales με διαφορετικούς τρόπους ζωής και παρείχαν ένα πολύτιμο σύνολο δεδομένων για μελλοντικές συγκριτικές μελέτες μεγάλης κλίμακας για την απόκτηση πληροφοριών σχετικά με τους μηχανισμούς που σχετίζονται με κάθε τρόπο ζωής και τις εξελικτικές πορείες που τους διαμόρφωσαν. Εκτός από τις εκτεταμένες συγκριτικές γονιδιωματικές προσεγγίσεις, χρησιμοποιήθηκαν πρόσθετες ομικές μέθοδοι για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων φυτού-ξενιστή και εντομοπαθογόνου μύκητα. Δύο ενδοφυτικά στελέχη εντομοπαθογόνων μυκήτων, τα Metarhizium brunneum V275 και Beauveria brongniartii BIPESCO2, εμβολιάστηκαν σε φυτά ντομάτας (Solanum lycopersicum). Επιπλέον, σε ένα επιπρόσθετο πείραμα, ο φυτοπαθογόνος μύκητας Verticillium dahliae συνεμβολιάστηκε με αυτούς τους μύκητες στα φυτά. Οι μεταγραφωματικές και μεταβολομικές αναλύσεις άνω των 300 δειγμάτων που συλλέχθηκαν σε διάστημα δύο μηνών θα βοηθήσουν στον εντοπισμό των μοριακών μηχανισμών και των μεταβολικών διεργασιών που ενεργοποιούνται κατά τα πρώιμα και τα όψιμα στάδια του αποικισμού από εντομοπαθογόνους μύκητες. Στο κεφάλαιο δέκα, η πρωτεομική ανάλυση επιλεγμένων δειγμάτων έδειξε αλλαγές στην παραγωγή των πρωτεϊνών μυκήτων στα φυτά, ενώ το πρωτεώμα του φυτού-ξενιστή παρέμεινε αμετάβλητο. Συνολικά, αυτή η διατριβή πρόσθεσε νέες πληροφορίες σχετικά με τους γενετικούς μηχανισμούς που αποτελούν τη βάση του ενδοφυτισμού και της εντομοπαθογένειας των εντομοπαθογόνων μυκήτων που ανήκουν στα γένη Metarhizium και Beauveria. Η μελέτη αυτή καταδεικνύει ότι ενώ οι πρωτογενείς μεταβολικές λειτουργίες διατηρούνται σε μεγάλο βαθμό, η διαφοροποίηση του δευτερογενούς μεταβολισμού αποτελεί σημαντικό παράγοντα οικολογικής εξειδίκευσης, διαφοροποίησης του εύρους ξενιστών και λειτουργικής ευελιξίας. Συνδυάζοντας τη συγκριτική γονιδιωματική με λειτουργικές δοκιμασίες και πολυ-ομικές προσεγγίσεις, η εργασία αυτή προωθεί την κατανόησή μας για την εξελικτική και μηχανιστική βάση των τρόπων ζωής των εντομοπαθογόνων μυκήτων και υπογραμμίζει τη σημαντική δυναμική τους για εφαρμογή στη βιώσιμη διαχείριση παρασίτων και στην πράσινη γεωργία.