An in vitro model for the investigation of mitochondrial dynamics and quality control in Parkinson’s disease using human pluripotent stem cell-derived midbrain dopamine neurons

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is a common neurodegenerative disorder characterised by severe motor and cognitive disabilities, caused by a profound loss of the midbrain dopaminergic neurons (mDANs). Although symptomatic treatment provides short-term relief, an absolute cure for PD is lacking, mainly because the aetiology of the disorder remains essentially elusive. Pathogenesis of PD has been associated with ageing, environmental and genetic factors: a common denominator being mitochondrial malfunction. Indeed, the identification of specific gene mutations associated with familial early onset PD is improving our understanding of the molecular mechanisms underlying this disease. Several of these genes mediate mitochondrial dynamics (fusion, fission, transport, mitophagy), and there is accumulating evidence that mitochondrial dysfunction is a key player in PD pathogenesis. In this respect, induced pluripotent stem cell (iPSC) technology represents an essential tool as it allows the in vitro modelling of the disease by obtaining human mDANs generated from reprogrammed adult cells derived from PD patients (e.g. dermal fibroblasts). However, insufficient quality, quantity and regional specification of the generated neurons, as well as highly heterogenic cultures could comprise the experimental outcomes, especially when investigating the sensitive to multiple factors mitochondria. This PhD aims to provide a complete in vitro model to image and monitor mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control in mDANs that are vulnerable to PD. Following an introductory review on how mitochondrial dysfunction is related to PD, and a description of the general methods used in this study, the first result Chapter describes how combined approaches and techniques from the literature and previous in housegenerated neural differentiation methods led to the production of a suitable for mitochondrial investigation mDAN differentiation protocol. The second result Chapter presents how this protocol was further optimised to generate ~70% mDANs after 35 days of differentiation. The last result Chapter illustrates how the PSC-derived mDANs can be used to investigate mitochondrial dynamics and quality control using a variety of cell- and culture-based assessments. To conclude, this thesis presents an amenable, reproducible and expandable monolayer PSC-derived mDAN differentiation system specifically designed for the in vitro investigation of mitochondrial dynamics and quality control in PD.

Η νόσος Πάρκινσον είναι μια συχνή νευροεκφυλιστική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από σοβαρές κινητικές και γνωστικές διαταραχές, οι οποίες οφείλονται σε εκτεταμένη απώλεια των μεσεγκεφαλικών ντοπαμινεργικών νευρώνων. Παρότι η συμπτωματική θεραπεία προσφέρει βραχυπρόθεσμη ανακούφιση, δεν υπάρχει οριστική θεραπεία, κυρίως επειδή η αιτιολογία της νόσου παραμένει σε μεγάλο βαθμό αδιευκρίνιστη. Η παθογένεση της νόσου έχει συσχετιστεί με τη γήρανση, περιβαλλοντικούς και γενετικούς παράγοντες, με κοινό παρονομαστή τη μιτοχονδριακή δυσλειτουργία. Πράγματι, η ταυτοποίηση συγκεκριμένων γονιδιακών μεταλλάξεων που σχετίζονται με οικογενείς μορφές πρώιμης έναρξης της νόσου συμβάλλει στη βελτίωση της κατανόησης των μοριακών μηχανισμών που την υποκρύπτουν. Πολλά από τα γονίδια αυτά μεσολαβούν στη μιτοχονδριακή δυναμική, συμπεριλαμβανομένων της σύντηξης, της διάσπασης, της μεταφοράς και της μιτοφαγίας, ενώ αυξανόμενα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία αποτελεί βασικό παράγοντα στην παθογένεση της νόσου. Στο πλαίσιο αυτό, η τεχνολογία των επαγόμενων πολυδύναμων βλαστοκυττάρων αποτελεί ένα σημαντικό εργαλείο, καθώς επιτρέπει την εργαστηριακή προσομοίωση της νόσου μέσω παραγωγής ανθρώπινων μεσεγκεφαλικών ντοπαμινεργικών νευρώνων από επαναπρογραμματισμένα σωματικά κύτταρα ενηλίκων ασθενών, όπως οι δερματικοί ινοβλάστες. Ωστόσο, η ανεπαρκής ποιότητα, ποσότητα και τοπική εξειδίκευση των παραγόμενων νευρώνων, καθώς και η υψηλή ετερογένεια των κυτταρικών καλλιεργειών, ενδέχεται να επηρεάσουν τα πειραματικά αποτελέσματα, ιδιαίτερα κατά τη μελέτη των μιτοχονδρίων, τα οποία είναι ευαίσθητα σε πολλαπλούς παράγοντες. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη ενός ολοκληρωμένου εργαστηριακού μοντέλου για την απεικόνιση και την παρακολούθηση της μιτοχονδριακής δυναμικής και των μηχανισμών ποιοτικού ελέγχου σε μεσεγκεφαλικούς ντοπαμινεργικούς νευρώνες που είναι ευάλωτοι στη νόσο Πάρκινσον. Μετά από μια εισαγωγική ανασκόπηση της σχέσης μεταξύ μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας και νόσου Πάρκινσον, καθώς και την περιγραφή των γενικών μεθόδων που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή, το πρώτο κεφάλαιο αποτελεσμάτων περιγράφει πώς ο συνδυασμός προσεγγίσεων και τεχνικών από τη βιβλιογραφία και προηγούμενων εργαστηριακά ανεπτυγμένων μεθόδων διαφοροποίησης οδήγησε στην ανάπτυξη ενός πρωτοκόλλου διαφοροποίησης μεσεγκεφαλικών ντοπαμινεργικών νευρώνων κατάλληλου για τη μελέτη των μιτοχονδρίων. Το δεύτερο κεφάλαιο αποτελεσμάτων παρουσιάζει τη βελτιστοποίηση του πρωτοκόλλου αυτού, η οποία οδήγησε στην παραγωγή περίπου 70% μεσεγκεφαλικών ντοπαμινεργικών νευρώνων μετά από 35 ημέρες διαφοροποίησης. Το τρίτο κεφάλαιο αποτελεσμάτων παρουσιάζει τη χρήση των παραγόμενων νευρώνων για τη διερεύνηση της μιτοχονδριακής δυναμικής και των μηχανισμών ποιοτικού ελέγχου μέσω ποικίλων κυτταρικών και καλλιεργητικών προσεγγίσεων. Συμπερασματικά, η παρούσα διατριβή παρουσιάζει ένα εύχρηστο, αναπαραγώγιμο και επεκτάσιμο σύστημα διαφοροποίησης μεσεγκεφαλικών ντοπαμινεργικών νευρώνων σε μονοστρωματικές καλλιέργειες, ειδικά σχεδιασμένο για την εργαστηριακή διερεύνηση της μιτοχονδριακής δυναμικής και των μηχανισμών ποιοτικού ελέγχου στη νόσο Πάρκινσον.