Predicting therapeutic benefit of alemtuzumab in aggressive multiple sclerosis by measuring B cell tolerance checkpoint integrity

Abstract

Introduction: Multiple sclerosis (MS) is the most prevalent autoimmune disorder of the central nervous system, categorized into various subtypes, with relapsing-remitting MS (RRMS) being the most common. The high clinical efficacy of anti-CD20 therapies has highlighted the crucial role of B cells in disease pathogenesis. In RRMS, a defective peripheral tolerance checkpoint has been demonstrated. The monoclonal antibody (mAb) alemtuzumab targets CD52+ immune cells, mainly T and B cells, inducing their transient depletion. Although alemtuzumab is highly effective in eliminating MS activity, its application is associated with the frequent development of secondary autoimmune phenomena, most commonly thyroid-related. Whether these effects are linked to an alteration of B cell tolerance mechanisms is currently not known. Objectives: This dissertation aims to determine whether alemtuzumab influences B cell tolerance mechanisms by evaluating the integrity of the peripheral B cell tolerance checkpoint and the B cell receptors (BCRs) repertoire, in conjunction with clinical outcomes. Methods: To evaluate peripheral B cell tolerance checkpoint integrity in patients and controls, we constructed 138 recombinant mAbs from single mature naïve B cells and tested their poly- and autoreactivity. We examined three healthy donors (HDs), three immunotherapy-naïve MS patients, and six patients treated with alemtuzumab at comparable time points post-treatment (mean ± SD 3.8 ± 0.39 years). Moreover, we investigated BCR repertoire parameters by performing next-generation sequencing (NGS) and assessing tolerance mechanisms in the same subject groups. Results: Polyreactive and autoreactive fraction means did not differ significantly among the three subgroups. Presence of a high or low autoreactive fraction of naïve B cells in patients treated with alemtuzumab did not correlate with secondary autoimmunity at the time of sampling and with future MS activity, and therefore most likely reflects stochastic variation in the context of immune reconstitution. In BCR repertoire analysis, alemtuzumab-treated patients showed lower mean naïve complementarity-determining region 3 (CDR3) net charge compared to HDs (P=0.0036), an interesting yet isolated finding warranting further investigation. Conclusions: The transient CD52 depletion did not appear to significantly impact the main aspects of peripheral B cell tolerance, as evaluated through naïve B cell cloning and BCR NGS. Additionally, these tolerance parameters were not linked to secondary autoimmunity. This combined methodological approach may also be relevant for other immune reconstitution therapies.

Εισαγωγή: Η πολλαπλή σκλήρυνση (ΠΣ) αποτελεί τη συχνότερη αυτοάνοση διαταραχή του κεντρικού νευρικού συστήματος και ταξινομείται σε διάφορους κλινικούς υποτύπους, με τη διαλείπουσα–υποτροπιάζουσα πολλαπλή σκλήρυνση (ΔΥΠΣ) να αποτελεί τη συχνότερη μορφή της νόσου. Η υψηλή κλινική αποτελεσματικότητα των θεραπειών που στοχεύουν το CD20 έχει αναδείξει τον καθοριστικό ρόλο των Β λεμφοκυττάρων στην παθογένεση της νόσου. Στη ΔΥΠΣ έχει αποδειχθεί η ύπαρξη διαταραχής του μηχανισμού περιφερικής ανοχής των Β λεμφοκυττάρων. Το μονοκλωνικό αντίσωμα αλεμτουζουμάμπη στοχεύει τα CD52⁺ ανοσοκύτταρα, κυρίως τα Τ και Β λεμφοκύτταρα, προκαλώντας τη προσωρινή εξάλειψή τους. Παρότι η αλεμτουζουμάμπη είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική στην καταστολή της δραστηριότητας της ΠΣ, η χορήγησή της σχετίζεται με τη συχνή εμφάνιση δευτερογενών αυτοάνοσων φαινομένων, κυρίως συσχετιζόμενα με τον θυροειδή αδένα. Το κατά πόσο τα φαινόμενα αυτά σχετίζονται με μεταβολές στους μηχανισμούς ανοχής των Β λεμφοκυττάρων παραμένει μέχρι σήμερα άγνωστο. Στόχοι: Στόχος της παρούσας διατριβής είναι να διερευνηθεί κατά πόσο η αλεμτουζουμάμπη επηρεάζει τους μηχανισμούς ανοχής των Β λεμφοκυττάρων, μέσω της αξιολόγησης της ακεραιότητας της περιφερικής ανοχής των Β λεμφοκυττάρων, καθώς και του ρεπερτορίου των υποδοχέων των Β λεμφοκυττάρων (B cell receptors – BCRs), σε συνδυασμό με την κλινική εικόνα των ασθενών. Μέθοδοι: Για την αξιολόγηση της ακεραιότητας του περιφερικού μηχανισμού ανοχής των Β λεμφοκυττάρων σε ασθενείς και υγιείς μάρτυρες, δημιουργήθηκαν 138 ανασυνδυασμένα μονοκλωνικά αντισώματα από μεμονωμένα ναΐφ ώριμα Β λεμφοκύτταρα και εξετάστηκε η πολυδραστικότητα και η αυτοδραστικότητά τους. Μελετήθηκαν τρεις υγιείς δότες, τρεις ασθενείς με ΠΣ χωρίς προηγούμενη ανοσοθεραπεία και έξι ασθενείς με ΠΣ που είχαν λάβει θεραπεία με αλεμτουζουμάμπη σε συγκρίσιμα χρονικά σημεία μετά τη θεραπεία (μέση τιμή ± τυπική απόκλιση: 3,8 ± 0,39 έτη). Παράλληλα, διερευνήθηκαν παράμετροι του ρεπερτορίου των BCR, που σχετίζονται με μηχανισμούς ανοχής στις ίδιες ομάδες δειγμάτων. Αποτελέσματα: Οι μέσες τιμές των ποσοστών πολυαντιδραστικότητας και αυτοαντιδραστικότητας δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των τριών ομάδων δειγμάτων της μελέτης. Η παρουσία υψηλής ή χαμηλής αυτοδραστικότητας των ώριμων Β λεμφοκυττάρων στους ασθενείς που έλαβαν αλεμτουζουμάμπη δεν συσχετίστηκε με την εμφάνιση δευτεροπαθούς αυτοανοσίας κατά τον χρόνο λήψης των δειγμάτων ούτε με μελλοντική δραστηριότητα της ΠΣ και, ως εκ τούτου, πιθανότατα αντανακλά στοχαστική μεταβλητότητα στο πλαίσιο της ανοσολογικής επανασύστασης. Κατά την ανάλυση του ρεπερτορίου των BCR, οι ασθενείς που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με αλεμτουζουμάμπη παρουσίασαν χαμηλότερο μέσο καθαρό φορτίο της συμπληρωματικής καθοριστικής περιοχής 3 (complementarity-determining region 3 – CDR3) των ώριμων Β λεμφοκυττάρων σε σύγκριση με τους υγιείς δότες (P = 0,0036), εύρημα ενδιαφέρον αλλά μεμονωμένο, το οποίο χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. Συμπεράσματα: Η παροδική εξάλειψη των CD52⁺ κυττάρων δεν φάνηκε να επηρεάζει ουσιαστικά την περιφερική ανοχή των Β λεμφοκυττάρων, όπως αυτή αξιολογήθηκε μέσω της κλωνοποίησης ναΐφ Β κυττάρων και της ανάλυσης NGS BCR ρεπερτορίου. Επιπλέον, οι συγκεκριμένες παράμετροι ανοχής δεν συσχετίστηκαν με την εμφάνιση δευτερογενούς αυτοανοσίας. Η συνδυασμένη αυτή μεθοδολογική προσέγγιση ενδέχεται να είναι χρήσιμη και για άλλες θεραπείες ανοσολογικής επανασύστασης.