Διερεύνηση του ρόλου της α-συνουκλεΐνης στους μηχανισμούς μεταφοράς και έκκρισης πρωτεϊνών σε νευρικά κύτταρα

Abstract

α-Synuclein is a protein closely associated with Parkinson's disease, and its physiological role is constantly expanding. Studying physiological function allows the understanding of the cellular processes that are disrupted by pathology. It is known that α-synuclein is involved in the secretion of synaptic vesicles. Besides its regulatory role on the fusion pore dynamics, its contribution in the secretory vesicle exocytosis is unclear. The thesis aimed to investigate the role of α-synuclein with the secretory pathway, initially with regards to the mechanism of α-synuclein’s secretion and then with regards to its role in protein secretion. It was found that α-synuclein colocalizes with secretory vesicles in SH-SY5Y cells and primary neurons, but it’s not secreted via the conventional secretory pathway. Deletion of the TMED3 gene led to an increase in α-synuclein’s secretion, indicating the involvement of ERGIC proteins. Next, α-synuclein was studied with regards to the octameric exocytic complex (EXOC1-8), which mediates the exocytosis and maturation of secretory vesicles. Overexpression of EXOC3 led to the development of protrusions and an increase in α-synuclein levels. Deletion of the EXOC3 gene from SH-SY5Y cells led to destabilization of the complex, accumulation of secreted proteins in the cytoplasm, inhibition of the cell cycle, and the appearance of neuronal differentiation. The presence of α-synuclein proved to be important for the manifestation of this phenotype. A dynamic change in its levels was observed, as well as accumulation at the tips of the developing projections. In addition, α-synuclein and EXOC3 subunit’s proximity was observed in the cytoplasm and nucleus of SH-SY5Y cells and primary neurons, whereas they both localized on the membrane of the same secretory vesicles. A decrease in the levels of the exocytic complex was observed in the striatum of adult α-synuclein knock out mice, as well as an accumulation of the secreted neuropeptide NPY and the transmembrane SLC7A5 protein, part of the LAT1 transporter. Altogether, the findings highlight the functional interplay of α-synuclein and the exocytic complex and its role in membrane recycling. The dysregulation of the secretory pathway may contribute to the functional vulnerability of brain regions. The second part of the thesis focused on the evaluation of aggregated α-synuclein in red blood cells as a potential biomarker for Parkinson's disease. Pathological aggregated α-synuclein is a hallmark of the disease and can be detected in the blood, which has reinforced efforts to render it as a biomarker. Using a conformation specific ELISA, the levels of oligomeric and fibrillar α-synuclein were detected and it was found that the levels of aggregated α-synuclein in red blood cells are increased in patients with non-genetically determined Parkinson's disease. This increase was not related to age, disease duration, age of onset, or severity of motor and cognitive symptoms. No statistically significant increase was observed in genetically determined forms of Parkinson's disease, a finding consistent with differences in the biochemical characteristics of aggregates and the limited number of participants in these groups. In contrast, total α-synuclein levels in red blood cells did not differ between groups, but the ratio of aggregated to total α-synuclein improved the discriminatory efficiency of the method. In conclusion, measuring aggregated α-synuclein in red blood cells can effectively distinguish non-genetically determined Parkinson's disease. The use of an easily accessible biomaterial such as blood reinforces the importance of the finding in terms of finding reliable biomarkers for the disease.

Η α-συνουκλεΐνη είναι μια πρωτεΐνη στενά συνδεδεμένη με τη νόσο του Πάρκινσον, ωστόσο ο φυσιολογικός της ρόλος συνεχώς διευρύνεται. Η μελέτη της φυσιολογικής της λειτουργίας επιτρέπει την κατανόηση των κυτταρικών διεργασιών που διαταράσσονται με την παθολογία. Είναι γνωστό ότι η α-συνουκλεΐνη εμπλέκεται στην έκκριση των συναπτικών κυστιδίων και ρυθμίζει την κινητική του πόρου σύντηξης των εκκριτικών κυστιδίων. Στόχος της διατριβής ήταν η διερεύνηση της σχέσης της α-συνουκλεΐνης με τη συμβατική εκκριτική οδό, αρχικά ως προς το μηχανισμό έκκρισής της και ύστερα ως προς τον ρόλο της στην έκκριση πρωτεϊνών. Αρχικά, διαπιστώθηκε ότι η α-συνουκλεΐνη συνεντοπίζεται με εκκριτικά κυστίδια σε κύτταρα SH-SY5Y και πρωτογενείς νευρώνες, ωστόσο δεν εκκρίνεται μέσω της συμβατικής εκκριτικής οδού. Η απαλοιφή του γονιδίου TMED3 οδήγησε σε αύξηση της έκκρισης της α-συνουκλεΐνης, υποδεικνύοντας την εμπλοκή των πρωτεϊνών του ERGIC με το μηχανισμό έκκρισής της. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η λειτουργική σχέση της α-συνουκλεΐνης με το οκταμερές εξωκυστικό σύμπλοκο (EXOC1-8) που μεσολαβεί βασικές κυτταρικές λειτουργίες, όπως η εξωκυττάρωση και η ωρίμανση των εκκριτικών κυστιδίων. Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης EXOC3 οδήγησε σε ανάπτυξη προεκβολών και αύξηση των επιπέδων της α-συνουκλεΐνης. Η απαλοιφή του γονιδίου EXOC3 από τα κύτταρα SH-SY5Y οδήγησε σε αποσταθεροποίηση του εξωκυστικού συμπλόκου, συσσώρευση εκκρινόμενων πρωτεϊνών στο κυτταρόπλασμα, αναστολή του κυτταρικού κύκλου και εμφάνιση φαινοτύπου νευρωνικής διαφοροποίησης. Η παρουσία της α-συνουκλεΐνης αποδείχθηκε απαραίτητη για την εκδήλωση του παραπάνω φαινοτύπου. Παρατηρήθηκε δυναμική μεταβολή στα επίπεδά της, και συσσώρευση στις άκρες των αναπτυσσόμενων προεκβολών. Όσον αφορά τη φυσική τους αλληλεπίδραση, η α-συνουκλεΐνη εντοπίστηκε με την υπομονάδα EXOC3 στη μεμβράνη των εκκριτικών κυστιδίων καθώς και σε στενή εγγύτητα στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα. Σε επίπεδο ιστού, παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων του εξωκυστικού συμπλόκου στο ραβδωτό σώμα μυών που δεν εκφράζουν α-συνουκλεΐνη. Παράλληλα, παρατηρήθηκε συσσώρευση του εκκρινόμενου νευροπεπτιδίου NPY και συσσώρευση της πρωτεΐνης SLC7A5, μέρους του αντιμεταφορέα LAT1 στο ραβδωτό σώμα. Τα ευρήματα αναδεικνύουν τη λειτουργική σχέση της α-συνουκλεΐνης με το εξωκυστικό σύμπλοκο και το ρόλο της στην ανακύκλωση μεμβρανικών πρωτεϊνών και λιπιδίων. Η απορρύθμιση αυτών των μηχανισμών ενδέχεται να συμβάλλει στη λειτουργική ευπάθεια συγκεκριμένων εγκεφαλικών περιοχών. Το δεύτερο μέρος τη διδακτορικής διατριβής επικεντρώθηκε στην αξιολόγηση της συσσωματωμένης α-συνουκλεΐνης στα ερυθρά αιμοσφαίρια ως πιθανού βιοδείκτη της νόσου του Πάρκινσον. Η παθολογική συσσωματωμένη α-συνουκλεΐνη αποτελεί παθολογο-ανατομικό και βιοχημικό γνώρισμα της νόσου και δύναται να ανιχνευτεί στο αίμα, γεγονός που έχει ενισχύσει την προσπάθεια για αξιοποίησή της ως βιοδείκτη. Χρησιμοποιώντας ELISA ειδική στην ανίχνευση ολιγομερούς και ινώδους α-συνουκλεΐνης, διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα της συσσωματωμένης α-συνουκλεΐνης στα ερυθρά αιμοσφαίρια είναι αυξημένα σε ασθενείς με μη γενετικά προσδιορισμένη νόσο του Πάρκινσον. Η αύξηση αυτή δεν σχετίστηκε με την ηλικία, τη διάρκεια της νόσου, την ηλικία έναρξης ή τη βαρύτητα των κινητικών και γνωστικών συμπτωμάτων. Στις γενετικά καθορισμένες μορφές Πάρκινσον δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση, εύρημα που μπορεί να συνάδει με διαφοροποιήσεις στα βιοχημικά χαρακτηριστικά των συσσωματωμάτων ή να σχετίζεται με τον περιορισμένο αριθμό συμμετεχόντων στις συγκεκριμένες ομάδες. Αντίθετα, τα επίπεδα της ολικής α-συνουκλεΐνης στα ερυθρά αιμοσφαίρια δε διέφεραν μεταξύ ομάδων, ενώ η αναλογία συσσωματωμένης προς ολική α-συνουκλεΐνη βελτίωσε τη διακριτική ικανότητα της μεθόδου. Συμπερασματικά, η μέτρηση της συσσωματωμένης α-συνουκλεΐνης στα ερυθρά αιμοσφαίρια μπορεί να διακρίνει αποτελεσματικά τη μη γενετικά προσδιορισμένη νόσο του Πάρκινσον. Η χρήση ενός εύκολα προσβάσιμου βιοϋλικού όπως το αίμα, ενισχύει τη σημασία του ευρήματος ως προς την εύρεση αξιόπιστων βιοδεικτών της νόσου.