Pharmacometabolomic study of osteoarthritis and rheumatoid arthritis using mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy

Abstract

Introduction: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic, systemic autoimmune disease marked by synovial inflammation, pain, and progressive joint damage with substantial extra-articular morbidity. Despite therapeutic advances, durable remission remains elusive for many patients, underscoring the need for robust biomarkers for early diagnosis, monitoring disease activity and pain, and evaluation of therapeutic efficacy. Metabolomics and lipidomics enable quantitative phenotyping of perturbed amino-acid, energy, lipid and lipoprotein pathways in RA. This dissertation established a multi-platform framework combining proton nuclear magnetic resonance (1H-NMR) metabolomics and NMR-based lipoprotein and glycoprotein profiling, targeted mass-spectrometry (MS) lipidomics, urinary 1H-NMR metabolomics, and targeted oxylipin analysis to characterize RA biofluids, define clinically relevant metabolic signatures, and evaluate cross-platform analytical congruence. Aims: The principal aims of this dissertation were: (1) to characterize NMR-derived small molecules, lipoproteins and glycoprotein signals in RA plasma and explore the relation to inflammation, disease activity, and pain; (2) to define therapy-specific plasma metabolomic and lipidomic responses; (3) to profile the urinary metabolome as a non-invasive reflection of disease status; (4) to quantify lipid mediators related to inflammatory resolution, and (5) to validate an integrated single-aliquot NMR to MS workflow for translational application. Methods: RA patients and healthy volunteers from the ArthritisHeal project (ArthritisHeal) were recruited at the rheumatology outpatient clinic of General Hospital of Athens “Laikon”, and fasted plasma and preprandial urine were collected. RA patients were stratified by DAS28-CRP (Remission/Low/Moderate/High), therapy stage and type, and systemic inflammation (Low/High). 1H NMR metabolomics was employed to profile small molecules in plasma and urine. Glycoprotein signals (GlycA/B) were extracted from 1H-NMR spectra. Lipoprotein subclasses were quantified via the Bruker IVDr B.I.-LISA platform. Targeted plasma lipidomics (DMS-Shotgun Lipidomics Assistant; FIA-MRM) quantified over 700 isoform-resolved lipid species across multiple lipid classes. Targeted lipid mediator analysis, which allows for the quantification of structural lipids, fatty acids and pro-resolving mediators, was performed by reversed-phase liquid chromatography-tandem mass spectrometry (RPLC-MS/MS). A single-aliquot workflow enabled sequential IVDr B.I.-LISA and DMS-SLA analysis, facilitating quantitative cross-platform evaluation and integrative lipid-lipoprotein correlation mapping. Results: Plasma metabolites, lipoproteins and glycoproteins in RA (1H-NMR): RA patients exhibited a distinct plasma metabolic, lipoprotein and glycoprotein fingerprint, with reduced levels of lactic acid, formic acid, sarcosine and valine, elevated phenylalanine, tyrosine, triglycerides, cholesterol, apolipoproteins (A1, A2, B100), together with marked remodeling of LDL and HDL subclasses, and increased GlycA/B signals. Glycoproteins were significantly higher in DMARD-naive RA (AUC ≈ 0.9), validating these NMR-derived signals as robust inflammation markers. Remission was characterized by higher small dense HDL-4 and lower LDL-triglycerides than high activity RA. H4A1 alone distinguishes RA remission from active disease (AUC ≈ 0.8). DAS28 correlated positively with small dense LDL-triglycerides and glycoproteins, and inversely with large LDL and small HDL lipids, while VAS pain score was associated with LDL-triglycerides. Lipoprotein and lipid fingerprints after 6-week monotherapy: Short-term biologic and targeted synthetic DMARD treatment was accompanied by therapy-specific metabolic and lipoprotein signatures. IL-6R blockade induced marked increases in total and free cholesterol, triglycerides and apoB-containing lipoproteins (VLDL/IDL) with parallel elevations in TAG(18:1/18:2) and CE(18:2), consistent with enhanced hepatic lipoprotein synthesis. JAK inhibition promoted a more favorable profile with enrichment of HDL-4 particles, higher apoA1/apoA2 and reductions IDL/LDL cholesterol, triglycerides and selected sphingolipids. TNF inhibition produced more modest lipoprotein and lipid remodeling, while methotrexate and glucocorticoids showed characteristic small-molecule changes compatible with altered energy metabolism and increased lipolysis. These therapy-related patterns were statistically supported in some comparisons but remained exploratory due to sample size and heterogeneity. Targeted plasma lipidomics (DMS-SLA): RA patients displayed pronounced reductions in lysophosphatidylcholines (LPCs; class p≈1×10⁻⁵), particularly LPC(16:0), LPC(18:0), and LPC(20:4), together with lower cholesteryl esters CE(18:2) and CE(18:0). The most significant perturbations occurred in moderate disease activity, characterized by further LPC depletion and increased TAGs-containing arachidonic acid (FA(20:4)). Clinical monitoring markers, DAS28 and CRP positively correlated with diacylglycerols and ceramides, and inversely with CEs, sphingomyelins, and LPCs. Pain intensity (VAS) showed positive correlations with AA-containing TAGs (r≈0.30, p=1×10⁻⁵). In DMARD-naïve RA, reduced LPC species and elevated phosphatidic acid PA(34:5) achieved fair discrimination versus controls (AUC>0.70), while refractory RA showed pronounced LPC(20:4) depletion (AUC=0.91) and increased TAG species. Urine 1H-NMR metabolomics: Untargeted ¹H-NMR of urine revealed a reproducible RA signature involving amino-acid, energy and gut-derived metabolites. Active RA exhibited lower branched-chain amino acids, 3-hydroxyisovalerate, glucose and citrate, consistent with increased catabolic demand and altered tricarboxylic acid cycle flux. DAS28, ESR and VAS were inversely associated with valine, citrate, creatinine and 3-hydroxybutyrate and positively associated with 3-indoxyl sulfate and phenylacetylglutamine, implicating BCAA, TCA and tryptophan/indole pathways in RA activity and symptom burden. DMARDnaïve and refractory RA showed distinct urinary profiles, and therapy-type comparisons indicated differential modulation of creatinine, citrate and TMAO. Cross-fluid coupling linked urinary citrate with small HDL-4 features, supporting urine as a non-invasive surrogate of systemic metabolic remodeling. Oxylipins and inflammation resolution: Targeted lipid mediator profiling detected 31 oxylipins, of which 13 individual mediators and 5 ratios differed significantly between RA and controls and across RA inflammation strata. HETE and HDHA isomers were prominently altered. 5-HETE and the AA:5-HETE ratio showed the strongest discrimination between high- and low-inflammation RA (AUC ≈ 0.74-0.77), indicating perturbed 5-lipoxygenase pathway flux and impaired resolution in highly inflamed disease. Multiple HETE and HDHA species correlated with DAS28 and even more strongly with VAS (r ≈ 0.50-0.68), and multivariate models demonstrated that composite oxylipin profiles best captured pain in high inflammation RA (R² ≈ 0.82). Methodological congruence and complementarity of IVDr B.I.-LISA and DMS-SLA: Sequential singlealiquot IVDr B.I.-LISA and DMS-SLA analyses showed excellent agreement at the lipid-class level and comparable diagnostic performance in distinguishing RA from controls. The validated workflow enabled robust lipoprotein–lipid correlation mapping, revealing biologically coherent lipid-lipoprotein relationships and underscoring the complementarity of NMR- and MS-based lipid measurements. Conclusions: This thesis establishes a clinically anchored, multi-modal framework linking RA phenotypes to coordinated alterations across plasma lipoproteins, glycoproteins, lipid species, urinary metabolites, and lipid mediators. Key conclusions are: 1. Lipoprotein profiles in RA correlate with disease activity, inflammation, and pain. Large HDL, intermediate LDL and glycoproteins serve for RA monitoring as well as potential molecular markers of pain. 2. Therapy-specific lipid remodeling reflects both drug action and disease activity in RA, with IL-6R blockade elevating VLDL/IDL lipids and JAK inhibition enhancing HDL subclasses. These findings highlight distinct metabolic signatures that may serve as biomarkers of therapeutic response. 3. RA is defined by consistent LPC depletion and selective remodeling of cholesteryl ester and TAG species, which closely reflect disease activity and pain intensity. These findings highlight specific lipid species as sensitive biomarkers of inflammatory burden and disease state in RA. 4. The urinary metabolome in RA reflects integrated metabolic disturbances encompassing amino acid catabolism, mitochondrial energy turnover, and gut-microbial co-metabolism. Reduced levels of BCAAs, citrate, and creatinine, together with elevated 3-indoxyl sulfate and TMAO, define a reproducible urinary signature associated with inflammation and pain. Urinary NMR metabolomics may thus complement blood-based profiling for non-invasive monitoring of RA disease activity and therapeutic response. 5. This study identifies HETE and HDHA derivatives, particularly 5-HETE and AA:5-HETE, as potential lipid biomarkers reflecting inflammatory burden and pain in RA. The findings suggest that dysregulation of arachidonic acid metabolism contributes to persistent inflammation and nociception, highlighting the therapeutic potential of targeting lipoxygenase-derived lipid mediators in RA. 6. A validated single-aliquot NMR/MS workflow demonstrates cross-platform congruence and enables joint lipid-lipoprotein correlation maps that are sensitive to disease state, supporting clinical translation and future mechanistic studies.

Εισαγωγή: Η ρευματοειδής αρθρίτιδα (ΡΑ) είναι μια χρόνια, συστηματική αυτοάνοση νόσος, που χαρακτηρίζεται από φλεγμονή του αρθρικού υμένα, πόνο και προοδευτική καταστροφή των αρθρώσεων, και σημαντική εξωαρθρική νοσηρότητα. Παρά τις συνεχείς εξελίξεις στην τεχνολογία των θεραπειών, η επίτευξη σταθερής ύφεσης παραμένει δυσχερής για πολλούς ασθενείς, γεγονός που αναδεικνύει την ανάγκη για αξιόπιστους βιοδείκτες πρώιμης διάγνωσης, την παρακολούθησης της ενεργότητας της νόσου και του πόνου, καθώς και αξιολόγησης θεραπευτικής απόκρισης. Η μεταβολομική και η λιπιδωμική προσφέρουν ποσοτική φαινοτυπική αποτύπωση διαταραγμένων οδών αμινοξέων, ενέργειας, λιπιδίων και λιποπρωτεϊνών στη ΡΑ. Η παρούσα διατριβή καθιέρωσε ένα πολυ-πλατφορμικό πλαίσιο που συνδυάζει μεταβολομική ¹H-NMR πλάσματος και ούρων, και στοχευμένη ανάλυση του προφίλ λιποπρωτεϊνών και γλυκοπρωτεϊνών με ¹H-NMR, στοχευμένη λιπιδωμική και ανάλυση οξυλιπινών με MS, ώστε να χαρακτηρισουν την ΡΑ, να ορίσουν κλινικά συναφή μεταβολικά και λιπιδικά προφίλ. Σκοποί: Οι κύριοι σκοποί της διατριβής ήταν: (1) ο χαρακτηρισμός μικρών μορίων, λιποπρωτεϊνών και σημάτων γλυκοπρωτεϊνων στο πλάσμα ασθενών με ΡΑ, μέσω ¹H-NMR, και η διερεύνηση της σχέσης αυτών με τη φλεγμονή, την ενεργότητα της νόσου και τον πόνο, (2) ο καθορισμός του μεταβολικού και λιπιδικού προφιλ αποκρίσης σε θεραπεία για ΡΑ, (3) η αποτύπωση του μεταβολομικού προφίλ των ούρων ως μη επεμβατικής αντανάκλασης της κατάστασης της νόσου, (4) η ποσοτικοποίηση λιπιδικών μεσολαβητών που σχετίζονται με την επίλυση της φλεγμονής, και (5) η επικύρωση ενός ολοκληρωμένου μονο-δειγματικού πρωτοκόλλου NMR- MS για μεταφραστική εφαρμογή. Μεθοδολογία: Ασθενείς με ΡΑ και υγιείς εθελοντές εντάχθηκαν στη μελέτη στο πλαίσιο του προγράμματος ArthritisHeal στο ΓΝΑ «Λαϊκό», στα Ρευματολογικά εξωτερικά ιατρεία. Συλλέχθηκαν δείγματα πλάσματος (νηστείας) και ούρων. Οι ασθενείς ταξινομήθηκαν βάσει DAS28-CRP (Ύφεση/Χαμηλή/Μέτρια/Υψηλή), σταδιου και τύπου θεραπείας, καθώς και επιπέδου συστηματικής φλεγμονής (Χαμηλή/Υψηλή). Η μεταβολομική ¹H-NMR χρησιμοποιήθηκε για το χαρακτηρισμό του προφίλ μικρών μορίων στο πλάσμα και στα ούρα. Τα σήματα γλυκοπρωτεϊνικών (GlycA/B) εξήχθησαν από φάσματα ¹H-NMR, ενώ η σύσταση και οι υποκατηγορίες λιποπρωτεϊνών ποσοτικοποιήθηκαν με την πλατφόρμα Bruker IVDr B.I.-LISA. Η στοχευμένη ανάλυση λιπιδωμικής στο πλάσμα πραγματοποιήθηκε με DMS-Shotgun Lipidomics Assistant, FIA-MRM) και επιτεύχθηκε η ποσοτικοποίηση >700 ειδών λιπιδίων. Η στοχευμένη ανάλυση λιπιδικών μεσολαβητών πραγματοποιήθηκε με RPLC-MS/MS. Τέλος, αναπτύχθηκε μονο-δειγματικό πρωτόκολλο για διαδοχικές αναλύσεις IVDr B.I.-LISA και DMS-SLA, διευκολύνοντας την ποσοτική διαπλατφορμική αξιολόγηση και ολοκληρωμένη χαρτογράφηση συσχετίσεων μεταξύ λιπιδίων και λιποπρωτεϊνών. Αποτελέσματα: Μεταβολίτες, λιποπρωτεΐνες και γλυκοπρωτεΐνες πλάσματος (NMR): Οι ασθενείς με ΡΑ παρουσίασαν ένα διακριτό μεταβολικό, λιποπρωτεϊνικό και γλυκοπρωτεϊνικό αποτύπωμα που χαρακτηρίστηκε από μειωμένα επίπεδα γαλακτικού και μυρμηκικού οξέος, σαρκωσίνη, βαλίνη, αλλά και αυξημένα επίπεδα φαινυλαλανίνης, τυροσίνης, τριγλυκεριδίων, χοληστερόλης, απολιποπρωτεινών (A1, A2, B100), σε συνδυασμό με μεταβολές στη σύσταση των LDL και HDL, και αυξημένα GlycA/B. Τα γλυκοπρωτεϊνικά σήματα ήταν σημαντικά υψηλότερα σε DMARD naive ΡΑ (AUC ≈ 0,9), με άριστη διακριτική ικανότητα έναντι των μαρτύρων, επικυρώνοντας τα σήματα NMR ως βιοδείκτες φλεγμονής. Η ύφεση συνδέθηκε με υψηλότερη συγκέντρωση μικρών πυκνών HDL (HDL-4) και χαμηλότερα επίπεδα LDL-τριγλυκεριδίων. Μεμονωμένα, ο δείκτης H4A1 χαρακτήρισε την ύφεση (AUC ≈ 0,8) με καλή διακριτική ικανότητα. Ο δείκτης πόνου, VAS, συσχετίστηκε με LDL-τριγλυκερίδια, ενώ το DAS28 με τριγλυκερίδια σε πυκνά LDL- και γλυκοπρωτεΐνες, και αντιστρόφως με μεγάλα LDL και λιδιπικά στελέχη σε πυκνά HDL λιπίδια. Λιποπρωτεϊνικά/λιπιδικά αποτυπώματα μετά 6 εβδομάδες μονοθεραπείας: Η βραχυπρόθεσμη χορήγηση μονοθερεπείας βιολογικών και στοχευμένων συνθετικών DMARD οδήγησε στην ανίχνευση συγκεκριμένων προφίλ απόκρισης. Η αναστολή του υποδοχέα της IL-6 προκάλεσε σημαντική αύξηση σε ολική και ελεύθερη χοληστερόλη, τριγλυκερίδια και ApoB στα VLDL/IDL, με παράλληλες αυξήσεις TAG(18:1/18:2), CE(18:2), συμβατές με ενισχυμένη ηπατική ηπατική σύνθεση λιποπρωτεϊνών. Η αναστολή JAK προήγαγε ενα ευνοϊκότερο προφίλ, με εμπλουτισμό σωματιδίων HDL-4, υψηλότερες συγκεντρώσεις ApoA1/ApoA2, και μειώσεις χοληστερόλης και τριγλυκεριδίων IDL/LDL, και επιλεγμένων σφιγγολιπιδιών. Η αναστολη TNF προκάλεσε ηπιότερη αναδιαμόρφωση λιποπρωτεϊνών και λιπιδίων ενώ η μεθοτρεξάτη και τα γλυκοκορτικοειδή συνδέθηκαν με χαρακτηριστικές μεταβολικές μεταβολές, συμβατές με αλλοίωση του ενεργειακού μεταβολισμού και αυξημένη λιπόλυση. Τα θεραπευτικά σχετιζόμενα αυτά πρότυπα υποστηρίχθηκαν στατιστικά σε ορισμένες συγκρίσεις, αλλά παραμένουν διερευνητικά λόγω μεγέθους δείγματος και ετερογένειας. Στοχευμένη λιπιδωμική ανάλυση πλάσματος (DMS-SLA): Το λιπιδικό προφίλ στην ΡΑ παρουσίασε σημαντικές μεταβολές. Παρατηρήθηκε μειώση των λυσοφωσφατιδυλοχολινών (LPC, p≈1×10⁻⁵), ιδιαίτερα LPC(16:0), LPC(18:0), LPC(20:4), καθώς και χαμηλότερα επίπεδα εστέρων χοληστερόλης CE(18:2), CE(18:0). Οι μεγαλύτερες διαταραχές σημειώθηκαν στο προφίλ των ασθενών με μέτρια ενεργότητα, που χαρακτηρίστηκε απο περαιτέρω μείωση LPC, και αύξηση των τριγλυκεριδιων με αραχιδονικό οξύ (ΑΑ; FA(20:4)). Το DAS28 και η CRP συσχετίστηκαν θετικά με διακυλογλυκερόλες και κεραμίδια, και αρνητικά με CE, σφιγγομυελίνες και LPC. Ο πόνος (VAS) συσχετίστηκε θετικά με TAGs που περιέχουν AA (r≈0.30, p=1×10⁻⁵). Τα μειωμένα επίπεδα LPC και τα αυξημένα PA(34:5) έδειξαν καλή προβλεπτική ικανότητα στη διάκριση των DMARD-naive ΡΑ, από μάρτυρες (AUC>0.70), ενώ στην persistent ΡΑ παρατηρήθηκε έντονη μείωση LPC(20:4) (AUC=0.91) και αύξηση TAGs. Μεταβολομική ούρων με χρήση¹H-NMR: Από την μελέτη των ούρων ταυτοποιήθηκαν 64 μεταβολίτες. Η ΡΑ υψηλής ενεργότητας χαρακτηρίστηκε από χαμηλότερα επίπεδα BCAA (βαλίνη, λευκίνη, ισολευκίνη) και 3-υδροξυϊσοβαλερικού οξέος, ένδειξη αυξημένη χρήσης BCAA, καθώς και χαμηλότερη γλυκόζη και κιτρικού οξέος, που συνδέεται με μειωμένη είσοδο μορίων στον κύκλο του Krebs. Η μελέτη συσχέτισης των μεταβολιτών στα ούρα με τους δείκτες παρακολούθησης της νόσου DAS28, VAS, ESR ανέδειξε αντίστορφη συσχέτιση των δεικτών με τα ακόλουθα: βαλίνη, κιτρικό οξλυ, κρεατινίνη, 3 υδροξυβουτυρικό οξύ και θετική συσχέτιση με τη 3-ινδοξυλοθειικό και το PAG. Η ανάλυση μεταβολικών μονοπατιών ανέδειξε διαταραχές στον μεταβολισμό αμινοξέων, ενέργειας και σωμάτων κετονών. Η ενεργότητα και το θεραπευτικό στάδιο επηρέασαν το λιπιδικό προφίλ. Οι υποομάδες DMARD-naive και PIRRA έδειξαν διακριτά προφίλ, ενώ οι συγκρίσεις με τον τύπο θεραπείας ανέδειξαν διαφοροποίηση σε κρεατινίνη, κιτρικό οξύ και TMAO. Η σύζευξη πλάσματος-ούρων ανέδειξε σημαντικές συσχετίσεις ανάμεσα στο κιτρικό οξύ των ούρων και τα πυκνά HDL-4, συνδέοντας τον συστηματικό ενεργειακό μεταβολισμό με την αναδιαμόρφωση των λιποπρωτεϊνών. Οξυλιπίνες και επίλυση φλεγμονής: Ανιχνεύθηκαν 31 οξυλιπίνες, από τις οποίες 13 μεμονωμένοι δείκτες και 5 λόγοι αυτών, διέφεραν σημαντικά. Τα ισομερή HETE και HDHA εμφάνισαν έντονες μεταβολές τόσο μεταξύ ΡΑ και μαρτύρων όσο και μεταξύ υποομάδων ΡΑ. Το 5-HETE και ο λόγος AA:5-HETE είχαν τη μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα μεταξύ υψηλής και χαμηλής φλεγμονής (AUC=0,74 και 0,77), υποδηλώνοντας αύξηση του μεταβολισμού μέσω 5-λιποξυγενάσης και ανεπαρκή επίλυση της φλεγμονής. Ισομερή HETE/HDHA συσχετίστηκαν με DAS28 (r≈0.45–0.55) αλλά ισχυρότερα με τον δείκτη πόνου VAS (r≈0,50–0,68). Το συνολικό προφίλ των οξυλιπινών αποτυπώνει ακριβέστερα τον πόνο στην ομάδα υψηλής φλεγμονής (R²=0.82). Μεθοδολογική συμφωνία και συμπληρωματικότητα IVDr B.I.-LISA και DMS-SLA: Η διαδοχική ανάλυση IVDr B.I.-LISA και DMS-SLA στο ίδιο δείγμα έδειξε εξαιρετική συμφωνία σε επίπεδο λιπιδίων και συγκρίσιμη διαγνωστική ικανότητα στη διάκριση ΡΑ από μάρτυρες. Αυτό το επικυρωμένο πρωτόκολλο επέτρεψε αξιόπιστη ανίχνευση συσχετίσεων ανάμεσα σε λιποπρωτεϊνες και λιπίδια, αναδεικνύοντας βιολογικά ουσιώδεις συνδέσεις σχετικές με τη νόσο, και υπογραμμίζοντας τη συμπληρωματικότητα των μετρήσεων λιπιδίων βασισμένα σε ¹H-NMR και MS. Συμπεράσματα: Η παρούσα διατριβή εδραιώνει ένα ολοκληρωμένο, κλινικά προσανατολισμένο μεταβολομικό και λιπιδωμικό πλαίσιο, το οποίο συνδέει τα κλινικά χαρακτηριστικά της ΡΑ με συντονισμένες διαταραχές σε λιποπρωτεΐνες, γλυκοπρωτεΐνες, λιπιδικά είδη, μεταβολίτες ούρων και λιπιδικούς μεσολαβητές. Κύρια συμπεράσματα: 1. Το λιποπρωτεϊνικό προφίλ στη ΡΑ συσχετίζεται με την ενεργότητα της νόσου, τη φλεγμονή και τον πόνο. Τα·πυκνά HDL-4, ενδιάμεσα LDL-2/3 και οι γλυκοπρωτεΐνες είναι χρήσιμοι δείκτες για την παρακολούθηση της νόσου. 2. Η θεραπείες στη ΡΑ επιφέρουν ειδική αναδιαμόρφωση λιπιδίων που αντανακλά μηχανισμό φαρμάκου και κατάσταση νόσου: η αναστολή του IL-6R αυξάνει VLDL/IDL, ενώ η αναστολή JAK ενισχύει τα HDL-4. Αυτές οι διακριτές μεταβολές έχουν δυνητική αξία ως βιοδείκτες απόκρισης σε θεραπεία. 3. Η ΡΑ χαρακτηρίζεται από σημαντική μείωση των LPC και επιλεκτική αναδιαμόρφωση χοληστερυλεστέρων και TAG, τα οποία συσχετίζονται την ενεργότητα της και τον πόνο. 4. Το μεταβολομικό προφίλ των ούρων χαρακτηρίζεται από διαταραχές σε διάφορα μονοπάτια. Μειωμένα BCAA, κιτρικό οξύ και κρεατινίνη, με αυξημένα 3-ινδοξυλοθειικό οξύ και TMAO, συσχετίζονται με τη φλεγμονή και τον πόνο. 5. Τα παράγωγα HETE/HDHA, ιδίως 5-HETE και ο λόγος AA:5-HETΕ, αναδεικνύονται ως πιθανοί λιπιδικοί δείκτες φλεγμονής και πόνου. η απορρύθμιση του μεταβολισμού του AA συμβάλει στην επίμονη φλεγμονή και πόνο. 6. Η επικύρωση του μονο-δειγματικού πρωτοκόλλου NMR/MS ανέδειξε υψηλή διαπλατφορμική συνέπεια και δυνατότητα ενοποιημένης ανάλυσης λιπιδίων–λιποπρωτεϊνών, ευαίσθητης στη δραστηριότητα της νόσου, αποτελώντας εργαλείο για κλινική μετάφραση και μελλοντικές μηχανιστικές μελέτες.