Investigation of genome organization dynamics in SLE through the analysis of multi-omics data

Abstract

This doctoral thesis investigates the molecular mechanisms regulating gene expression in systemic lupus erythematosus (SLE), a complex autoimmune disease characterized by molecular heterogeneity and strong sex bias. The study aimed to elucidate how alternative pre-mRNA splicing, sex-dependent transcriptional programs and three-dimensional genome organization interact to shape disease pathogenesis, while also identifying early molecular signatures associated with progression from preclinical autoimmunity to clinically established SLE. Integrated transcriptomic and epigenomic analyses were performed using datasets from SLE patients, healthy donors and experimental models. RNA sequencing of whole blood and purified immune cell populations was combined with chromatin profiling and spatial genome data to explore the relationships between genome architecture, transcriptional activity and RNA processing. Widespread dysregulation of alternative splicing was observed in SLE, with intron retention (IR) emerging as the predominant event. IR occurred more frequently in healthy individuals than in patients, suggesting that inflammatory activation is associated with reduced intron retention. The limited overlap between differentially spliced and differentially expressed genes indicates that alternative splicing represents a largely independent regulatory layer. Although splicing patterns displayed strong cell-type specificity, IR remained the dominant feature across immune populations, highlighting its importance in SLE gene regulation. Sex-dependent analyses revealed differences in both gene expression and splicing. Notably, IR exhibited opposite patterns between health and disease, being enriched in healthy females compared to males but more prominent in male patients relative to female patients. The X-linked cohesin subunit SMC1A showed the strongest sex-dependent expression, particularly in CD14⁺ monocytes. During inflammatory activation, SMC1A redistributed to active enhancers of inflammatory genes and its silencing reduced their expression, supporting a role in amplifying inflammatory transcriptional programs. Higher expression of SMC1A-regulated genes in female patients suggests a potential contribution to the sexual dimorphism of SLE. Integration of spatial genome data further implicated SMC1A in inflammation-associated splicing reprogramming. Transcriptomic profiling of individuals at high risk for SLE demonstrated that molecular perturbations precede clinical onset, with enhanced interferon and inflammatory signaling representing key features of progression. A gene signature derived from comparative analyses predicted transition to SLE in an independent cohort using machine learning approaches, while in silico analyses suggested reversibility of pathogenic signatures following targeted biologic therapies. Collectively, this work proposes an integrated framework in which inflammatory activation, sex-dependent regulation and chromatin architecture jointly shape transcriptional and post-transcriptional programs in SLE. These findings advance the understanding of disease pathogenesis and support the potential utility of blood-based molecular markers for risk stratification and early therapeutic intervention.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή ασχολείται με τη διερεύνηση των μηχανισμών που διέπουν τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης στον Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (ΣΕΛ), ένα πολυσυστηματικό αυτοάνοσο νόσημα με έντονη μοριακή ετερογένεια και φυλετική προδιάθεση. Κεντρικός στόχος της εργασίας αποτελεί η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο τρία αλληλένδετα επίπεδα γονιδιακής ρύθμισης, το εναλλακτικό μάτισμα του πρώιμου mRNA, ο φυλετικός διμορφισμός των μεταγραφικών και μετα-μεταγραφικών προγραμμάτων και η οργάνωση του γονιδιώματος στον τρισδιάστατο πυρηνικό χώρο, συμβάλλουν στην παθογένεια της νόσου. Παράλληλα, εξετάστηκαν οι μεταγραφικές μεταβολές που χαρακτηρίζουν τη μετάβαση από την προκλινική αυτοανοσία στη νόσο, με στόχο τον εντοπισμό μοριακών υπογραφών που σχετίζονται με την εξέλιξη της νόσου και παρουσιάζουν προγνωστική αξία. Για την επίτευξη των στόχων της διατριβής αξιοποιήθηκαν δεδομένα μεταγραφικού και επιγενετικού προφίλ από ασθενείς με ΣΕΛ, υγιούς δότες και πειραματικά μοντέλα. Συγκεκριμένα, αναλύθηκαν δεδομένα RNA-sequencing ολικού αίματος από ασθενείς με ενεργό και ανενεργό ΣΕΛ και υγιή άτομα, ενώ στη συνέχεια οι αναλύσεις επεκτάθηκαν σε κυτταρικούς πληθυσμούς περιφερικού αίματος, τόσο από δεδομένα που παρήχθησαν στο εργαστήριο όσο και από δημοσιευμένα δοδεμένα. Απομονώθηκαν και μελετήθηκαν πληθυσμοί μονοκυττάρων υπό βασικές ή φλεγμονώδεις συνθήκες και ενσωματώθηκαν δεδομένα χρωματίνης (ChIP-, H3k27ac-, ATAC-sequencing). Τέλος, ενσωματώθηκαν δεδομένα τρισδιάστατης οργάνωσης/ακτινικής τοποθέτησης γονιδιωματικών περιοχών στον πυρήνα, προκειμένου να διερευνηθούν συσχετίσεις μεταξύ χωρικής αρχιτεκτονικής, μεταγραφικής ενεργοποίησης και προτύπων ματίσματος. Στο επίπεδο του εναλλακτικού ματίσματος, πραγματοποιήθηκε ανίχνευση, χαρακτηρισμός και ποσοτικοποίηση των γεγονότων ματίσματος, με τη χρήση του εργαλείου Vast-tools. Η ανάλυση αποκάλυψε εκτεταμένη απορρύθμιση των προτύπων ματίσματος στον ΣΕΛ, με τη συγκράτηση ιντρονίων (intron retention, IR) να αναδεικνύεται ως ο επικρατέστερος τύπος στις συγκρίσεις ασθενών έναντι υγιών. Τα γεγονότα IR εμφανίστηκαν συχνότερα στα μετάγραφα των υγιών σε σχέση με των ασθενών, υποστηρίζοντας ότι η νόσος συνοδεύεται από μείωση της IR, πιθανώς ως αποτέλεσμα φλεγμονώδους ενεργοποίησης. Επιπλέον, μέσω υπολογιστικών προσεγγίσεων, εξετάστηκε η εισαγωγή πρόωρων κωδικονίων λήξης σε μετάγραφα με IR και η πιθανή ενεργοποίηση του μονοπατιού αποικοδόμησης αυτών, στοιχείο που υποστηρίζει τον ρυθμιστικό ρόλο της IR στην τελική έκφραση του μεταγράφου. Παρατηρήθηκε μικρή επικάλυψη μεταξύ των διαφορικά συρραφόμενων γονιδίων και διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων, γεγονός που υποδηλώνει ότι το εναλλακτικό μάτισμα λειτουργεί σε μεγάλο βαθμό ως ανεξάρτητο επίπεδο ρύθμισης σε σχέση με τη συνολική γονιδιακή έκφραση. Η ανάλυση σε επιμέρους κυτταρικούς τύπους έδειξε έντονη κυτταρική εξειδίκευση των γεγονότων ματίσματος, με διαφορετικούς πληθυσμούς να συρράφουν διαφορετικά γονίδια, όταν συγκρίνονται ασθενείς με υγιείς. Παρά την εξειδίκευση, η IR παρέμεινε το κυρίαρχο είδος εναλλακτικού ματίσματος στους περισσότερους κυτταρικούς τύπους, με παρόμοια τάση (χαμηλότερη IR στους ασθενείς). Τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το εναλλακτικό μάτισμα αποτελεί σημαντικό και ανεξάρτητο επίπεδο ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης στον ΣΕΛ. Σε επίπεδο φυλετικού διμορφισμού, διερευνήθηκαν διαφορές τόσο στη γονιδιακή έκφραση, όσο και στα πρότυπα εναλλακτικού ματίσματος. Σε ό,τι αφορά το μάτισμα, διαπιστώθηκαν μεταβολές μεταξύ των φύλων, ενώ η IR παρουσίασε αντίθετη τάση μεταξύ υγιούς κατάστασης και ΣΕΛ: ήταν συχνότερη στις υγιείς γυναίκες έναντι των ανδρών, αλλά επικρατούσε στους ασθενείς άντρες συγκριτικά με τις γυναίκες. Τα γονίδια με φυλο-εξαρτώμενο μάτισμα στον ΣΕΛ εμπλουτίζονται σε μονοπάτια που σχετίζονται με αναδιαμόρφωση χρωματίνης, σηματοδότηση ιντερφερόνης και ανοσοαπόκριση. Το γονίδιο SMC1A, που εντοπίζεται στο χρωμόσωμα Χ και είναι μέλος του συμπλόκου cohesin, εμφάνισε την ισχυρότερη φυλο-εξαρτώμενη έκφραση στον ΣΕΛ και ιδιαίτερα στα CD14⁺ μονοκύτταρα. Κατά τη φλεγμονώδη ενεργοποίηση, η SMC1A ανακατανέμεται από περιοχές υποκινητών προς απομακρυσμένα ρυθμιστικά στοιχεία, όπως ενεργούς ενισχυτές γονιδίων που σχετίζονται με τη φλεγμονή. Η λειτουργική επικύρωση μέσω αποσιώπησης του γονιδίου SMC1A έδειξε μείωση της έκφρασης αυτών των γονιδίων. Επιπλέον, τα γονίδια που ρυθμίζονται θετικά από την SMC1A εμφάνισαν υψηλότερη έκφραση στις γυναίκες με ΣΕΛ έναντι των ανδρών, υποδηλώντας τη συμβολή της SMC1A στον φυλετικό διμορφισμό της νόσου. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η πιθανή σύνδεση μεταξύ τρισδιάστατης/ακτινικής οργάνωσης του γονιδιώματος, της μεταγραφικής ενεργοποίησης και των προτύπων ματίσματος. Διαπιστώθηκε ότι περιοχές με αυξημένη πρόσδεση SMC1A και αυξημένη μεταγραφική δραστηριότητα τείνουν να εμφανίζουν μετατόπιση προς την πυρηνική περιφέρεια κατά τη φλεγμονώδη απόκριση και χαρακτηρίζονται από χαμηλή περιεκτικότητα σε βάσεις GC και αρχιτεκτονική που ευνοεί την παράλειψη εξονίων. Παρατηρήθηκε ότι η μετάβαση από βασική σε φλεγμονώδη κατάσταση συνοδεύεται από μείωση της IR, ενώ μετά από αποσιώπηση SMC1A, η μείωση αυτή εξασθενεί. Αυτό υποδεικνύει ότι η SMC1A συμμετέχει στον επαναπρογραμματισμό του ματίσματος κατά την ενεργοποίηση της φλεγμονής. Το σύνολο των παρατηρήσεων υποστηρίζει ένα μοντέλο όπου η χωρική αρχιτεκτονική του γονιδιώματος και η δράση της SMC1A μπορούν να επηρεάζουν όχι μόνο τη μεταγραφή αλλά και το εναλλακτικό μάτισμα του RNA. Τέλος, μελετήθηκε η γονιδιακή έκφραση σε κοόρτη ατόμων υψηλού κινδύνου για ανάπτυξη ΣΕΛ, εκ των οποίων ένα ποσοστό εξελίχθηκε σε κλινικά ταξινομήσιμο ΣΕΛ (progressors), ενώ οι υπόλοιποι παρέμειναν σταθεροί (non-progressors). Η ανάλυση ανέδειξε ότι οι μοριακές διαταραχές προηγούνται της κλινικής εκδήλωσης της νόσου, με την ενισχυμένη σηματοδότηση της ιντερφερόνης και φλεγμονωδών κυτταροκινών να αποτελεί βασικό μοριακό χαρακτηριστικό της εξέλιξης προς ΣΕΛ. Παράλληλα, αναδείχθηκαν διαφορές σε μεταβολικά μονοπάτια όπως η οξειδωτική φωσφορυλίωση. Μια γονιδιακή υπογραφή ευαισθησίας, η οποία προέκυψε από τη συγκριτική ανάλυση progressors, non-progressors και υγιών ατόμων προέβλεψε τη μετάβαση προς ΣΕΛ σε ανεξάρτητη κοόρτη, μέσω της χρήσης μεθόδων μηχανικής μάθησης. Επιπλέον, η συγκριτική ανάλυση κατά μήκος του φάσματος από την υγιή κατάσταση έως τον διαγνωσμένο ΣΕΛ (υπογραφή εξέλιξης) ανέδειξε σταδιακή ενίσχυση της σηματοδότησης της ιντερφερόνης, του μεταβολισμού της αίμης και της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Τέλος, οι υπογραφές ευαισθησίας και εξέλιξης εμφάνισαν in silico αναστρεψιμότητα μετά από θεραπεία με στοχευμένους βιολογικούς παράγοντες, ενώ οι αναλύσεις επαναστόχευσης φαρμάκων (drug repurposing) ανέδειξαν υποψήφιους παράγοντες που ενδέχεται να αντιστρέφουν τα παθολογικά μεταγραφικά προφίλ. Τα ευρήματα υποστηρίζουν τη δυνατότητα αξιοποίησης μοριακών δεικτών του περιφερικού αίματος για την έγκαιρη αναγνώριση ατόμων υψηλού κινδύνου και τον σχεδιασμό στοχευμένων παρεμβάσεων πριν από την πλήρη εκδήλωση της νόσου. Η παρούσα διατριβή προτείνει ένα ενοποιημένο πλαίσιο σύμφωνα με το οποίο η φλεγμονώδης ενεργοποίηση, ο φυλετικός διμορφισμός και η τρισδιάστατη οργάνωση της χρωματίνης συνδιαμορφώνουν μεταγραφικά και μετα-μεταγραφικά προγράμματα στον ΣΕΛ. Η ανάδειξη της IR ως κεντρικού χαρακτηριστικού της μετα-μεταγραφικής ρύθμισης, η μηχανιστική εμπλοκή του SMC1A σε περιοχές ενισχυτών φλεγμονωδών γονιδίων και η ανίχνευση πρώιμων, προβλεπτικών υπογραφών στην προκλινική φάση συνεισφέρουν στην κατανόηση της παθογένειας και δημιουργούν προοπτικές για βελτιωμένη πρόγνωση, έγκαιρη διάγνωση και στοχευμένες θεραπευτικές παρεμβάσεις.