Study of new molecules with potential therapeutic activity in immune system disorders

Abstract

Inflammation and cancer are closely interconnected pathological processes that arise from dysregulated immune signaling, oxidative stress, and aberrant activation of intracellular signaling pathways. While acute inflammation constitutes an essential component of host defense, its chronic persistence contributes to genomic instability, tissue damage, and the formation of a tumor-supportive microenvironment. Concurrently, developing tumors exploit inflammatory mechanisms to promote their growth, evade immune surveillance, and remodel the surrounding tissues. This reciprocal relationship highlights the need for therapeutic approaches capable of targeting both inflammatory and oncogenic processes. Natural products, particularly olive-derived polyphenols such as oleuropein (OP) and oleocanthal (OC), have attracted interest due to their reported antioxidative, anti-inflammatory, and anticancer properties. Despite encouraging results in preclinical models, their therapeutic application is limited by low bioavailability, rapid metabolic clearance, and moderate potency. The present doctoral thesis addresses these limitations through the rational design and preclinical evaluation of semi-synthetic analogs of olive-derived polyphenols, aiming to identify compounds with improved biological activity and mechanistic specificity. The primary objective of this thesis was to identify, characterize, and mechanistically evaluate novel semi-synthetic analogs of OP and OC with enhanced therapeutic potential in immune-mediated inflammatory conditions and cancer. This was pursued through three complementary axes. Firstly, a library of 22 newly synthesized analogs was screened to identify compounds with superior anti-inflammatory and/or anticancer activity compared to the parental molecules, with emphasis on potency, selectivity, and safety toward non-malignant cells. Secondly, lead compounds were evaluated in established in vivo models of acute inflammation and cancer to assess whether their in vitro activity is translated into measurable therapeutic effects. Thirdly, cellular-, immunological-, and kinome-based approaches were employed to investigate the various mechanisms underlying the activity of the most promising compounds.Initial screening identified two structurally distinct lead compounds with divergent but complementary biological profiles. GS50 emerged as the most effective anti-inflammatory analog, whereas GS32 displayed the most pronounced anticancer activity. These compounds were, therefore, selected for further investigation as representative candidates targeting inflammation and cancer, respectively. GS50 exhibited consistent anti-inflammatory and antioxidative activity across multiple in vitro macrophage models of both human and murine origin. Under inflammatory stimulation, GS50 reduced reactive oxygen species production and suppressed the secretion of key pro-inflammatory cytokines, while exerting minimal cytotoxic effects on non-activated immune cells. This pattern suggests that GS50 primarily modulates inflammatory signaling rather than inducing nonspecific cytotoxicity. The anti-inflammatory activity of GS50 was subsequently confirmed in vivo using two models of acute inflammation: imiquimod-induced skin inflammation and acetic acid-induced colitis. In both models, treatment of mice with GS50 resulted in reduced macroscopic inflammation, preservation of tissue architecture, and decreased immune cell infiltration. The magnitude of these effects differed between mouse strains, with a more pronounced response observed in C57BL/6J mice compared to BALB/c mice, indicating a strain-dependent component that likely reflects differences in immune polarization between the two mouse strains. Taken together, these findings indicate that GS50 effectively attenuates acute inflammatory responses by targeting central inflammatory and oxidative stress-related pathways shared across different tissues and inflammatory stimuli. In addition to suppressing pro-inflammatory signaling, its ability to reduce reactive oxygen species production suggests that modulation of oxidative stress contributes to its overall mechanism of action. This dual anti-inflammatory and antioxidative activity profile supports its further evaluation as a candidate therapeutic compound for inflammatory conditions. GS32 was identified as the most potent anticancer analog, exhibiting cytotoxicity at very low micromolar concentrations across several human and murine cancer cell lines. GS32 demonstrated selectivity toward malignant cells while sparing normal immune cells, suggesting a favorable therapeutic window. Mechanistic analyses showed that GS32 suppressed tumor cell proliferation and induced apoptosis in a concentration- and time-dependent manner. These effects were accompanied by S-phase cell cycle arrest, consistent with interference with DNA replication and the associated immune checkpoint control mechanism. Importantly, GS32 did not solely exert cytostatic effects but actively promoted programmed cell death, indicating engagement of intrinsic stress-response pathways. Kinome profiling revealed that GS32 treatment resulted in a coordinated modulation of multiple signaling pathways. These included suppression of several serine/threonine kinases and altered activity of key protein tyrosine kinases, leading to broader reprogramming of pathways involved in proliferation, survival, inflammation, and cell cycle regulation. Network analyses supported the interpretation that these changes reflect integrated signaling responses rather than isolated kinase effects. The anticancer activity of GS32 was further validated in syngeneic mouse models of melanoma and colon carcinoma, where GS32 treatment delayed tumor growth without evidence of systemic toxicity. In addition to its direct effects on tumor cells, GS32 altered the tumor microenvironment by increasing both immune cell infiltration and activation. Ex vivo functional assays demonstrated enhanced cytotoxic activity of T lymphocytes and natural killer cells following GS32 treatment, indicating that GS32 contributes to antitumor immunity alongside its direct cytotoxic effects. These findings suggest that GS32 acts through both tumor-intrinsic and immune-mediated mechanisms. Combination studies with immune checkpoint blockade revealed improved effects, suggesting that GS32 may enhance tumor responsiveness to immunotherapy, as demonstrated by tumor growth retardation and increased infiltration of the tumor microenvironment by immune cells. Collectively, these findings demonstrate that GS32 exerts robust antitumor activity through a dual mechanism involving direct tumor cell cytotoxicity and indirect modulation of the antitumor immune response. By inducing S-phase arrest and apoptosis, GS32 disrupts key proliferative and survival pathways in cancer cells, an effect supported by coordinated kinome reprogramming at the network level. Its efficacy in syngeneic tumor models, absence of systemic toxicity, and capacity to enhance immune cell infiltration and cytotoxic function further underscore its therapeutic potential. Moreover, the improved outcomes observed in combination with immune checkpoint blockade suggest that GS32 may sensitize tumors to immunotherapy. Collectively, these data indicate GS32 as a promising anticancer candidate that engages both tumor-intrinsic and immune-mediated mechanisms of action. In conclusion, this thesis presents a comprehensive preclinical evaluation of semi-synthetic analogs of olive-derived polyphenols and demonstrates that rational structural modifications thereof can substantially enhance their biological activity. GS50 and GS32 were identified as lead compounds with distinct yet complementary profiles, targeting inflammatory and oncogenic processes, respectively. GS50 functions as a modulator of acute inflammatory responses, whereas GS32 exhibits robust anticancer activity through combined cytotoxic and immunomodulatory mechanisms, data which support their further investigation as candidates for translational exploitation.

Η φλεγμονή και ο καρκίνος συνιστούν στενά αλληλένδετες παθολογικές διεργασίες που προκύπτουν από την απορρύθμιση της ανοσολογικής σηματοδότησης, το οξειδωτικό στρες και τη μη φυσιολογική ενεργοποίηση ενδοκυττάριων σηματοδοτικών οδών. Ενώ η οξεία φλεγμονή αποτελεί βασικό μηχανισμό της άμυνας του οργανισμού, η παρατεταμένη ενεργοποίησή της και η μετάπτωσή της σε χρόνια κατάσταση προάγουν τη γονιδιακή αστάθεια, τη βλάβη των ιστών και τη διαμόρφωση ενός μικροπεριβάλλοντος που ευνοεί την ανάπτυξη όγκων. Παράλληλα, οι αναπτυσσόμενοι όγκοι εκμεταλλεύονται τους μηχανισμούς της φλεγμονώδους αντίδρασης για να προωθήσουν την ανάπτυξή τους, να διαφύγουν από την ανοσολογική επιτήρηση και να αναδιαμορφώσουν τους περιβάλλοντες ιστούς. Αυτή η αμφίδρομη σχέση υπογραμμίζει την ανάγκη για θεραπευτικές προσεγγίσεις ικανές να στοχεύουν τόσο τις φλεγμονώδεις όσο και τις ογκογόνες διαδικασίες. Τα φυσικά προϊόντα, ιδιαίτερα οι πολυφαινόλες που προέρχονται από την ελιά, όπως η ελευρωπαΐνη (oleuropein, OP) και η ελαιοκανθάλη (oleocanthal, OC), έχουν προσελκύσει το ερευνητικό ενδιαφέρον λόγω των αντιοξειδωτικών, αντιφλεγμονωδών και αντικαρκινικών ιδιοτήτων τους. Παρά τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα σε προκλινικά μοντέλα, η θεραπευτική τους χρήση περιορίζεται λόγω χαμηλής βιοδιαθεσιμότητας, ταχείας μεταβολικής αποδόμησης και μέτριας δραστικότητας. Η παρούσα διδακτορική διατριβή επιχειρεί να υπερβεί αυτούς τους περιορισμούς μέσω του ορθολογικού σχεδιασμού και της προκλινικής αξιολόγησης ημισυνθετικών αναλόγων πολυφαινολών που προέρχονται από την ελιά, με στόχο τον εντοπισμό ενώσεων με βελτιωμένη βιολογική δραστικότητα και μηχανιστική στόχευση. Ο κύριος στόχος αυτής της διατριβής ήταν η ταυτοποίηση, ο χαρακτηρισμός και η μηχανιστική διερεύνηση νέων ημισυνθετικών αναλόγων της OP και της OC με ενισχυμένο θεραπευτικό δυναμικό σε ανοσομεσολαβούμενες φλεγμονώδεις καταστάσεις και στον καρκίνο. Αυτό διερευνήθηκε μέσω τριών συμπληρωματικών αξόνων. Πρώτον, πραγματοποιήθηκε φαρμακολογική σάρωση μιας σειράς 22 νεοσυντεθέντων αναλόγων για τον προσδιορισμό των ενώσεων με βελτιωμένη αντιφλεγμονώδη ή/και αντικαρκινική δράση σε σύγκριση με τα πρόδρομα μόρια, με έμφαση στη δραστικότητα, την επιλεκτικότητα και την ασφάλεια έναντι φυσιολογικών κυττάρων. Δεύτερον, οι επικρατέστερες ενώσεις αξιολογήθηκαν σε καθιερωμένα in vivo μοντέλα οξείας φλεγμονής και καρκίνου, προκειμένου να εκτιμηθεί εάν η in vitro δράση μεταφράζεται σε μετρήσιμα θεραπευτικά αποτελέσματα. Τρίτον, εφαρμόστηκαν κυτταρικές, ανοσολογικές αναλύσεις και αναλύσεις σε επίπεδο δικτύου κινασών για τη χαρτογράφηση των μοριακών μηχανισμών που μεσολαβούν τη δράση των πλέον υποσχόμενων ενώσεων. Η αρχική σάρωση ανέδειξε δύο δομικά διακριτές ενώσεις με διαφορετικά αλλά συμπληρωματικά βιολογικά προφίλ. Η GS50 αναδείχθηκε ως το πιο αποτελεσματικό αντιφλεγμονώδες ανάλογο, ενώ η GS32 παρουσίασε την πιο έντονη αντικαρκινική δράση. Συνεπώς, αυτές οι ενώσεις επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη ως αντιπροσωπευτικοί παράγοντες έναντι της φλεγμονής και του καρκίνου, αντίστοιχα. Η GS50 επέδειξε σταθερή αντιφλεγμονώδη και αντιοξειδωτική δράση σε πολλαπλά in vitro μοντέλα μακροφάγων τόσο ανθρώπου όσο και ποντικού. Υπό φλεγμονώδη διέγερση, η GS50 μείωσε την παραγωγή δραστικών ριζών οξυγόνου και κατέστειλε την έκκριση βασικών προφλεγμονωδών κυτταροκινών, ενώ παρουσίασε ελάχιστη κυτταροτοξικότητα έναντι μη ενεργοποιημένων ανοσοκυττάρων. Αυτό το μοτίβο υποδηλώνει ότι η GS50 δρα κυρίως μέσω ρύθμισης της φλεγμονώδους σηματοδότησης και όχι μέσω μη ειδικής κυτταροτοξικότητας. Η αντιφλεγμονώδης δράση της GS50 επιβεβαιώθηκε στη συνέχεια in vivo, χρησιμοποιώντας δύο μοντέλα οξείας φλεγμονής: του δέρματος που επάγεται από ιμικιμόδη, και κολίτιδα που επάγεται από οξικό οξύ. Η χορήγηση της GS50 οδήγησε σε μείωση των μακροσκοπικών δεικτών φλεγμονής, την ταχύτερη επαναφορά της αρχιτεκτονικής των ιστών και τον περιορισμό της διήθησης από ανοσοκύτταρα και στα δύο μοντέλα. Η ένταση της απόκρισης διέφερε μεταξύ των φυλών των ποντικών, με εντονότερα αποτελέσματα να παρατηρούνται στους ποντικούς C57BL/6J σε σύγκριση με τους BALB/c, υποδηλώνοντας μια εξαρτώμενη από τη φυλή συνιστώσα που πιθανώς αντανακλά διαφορές στην πόλωση της ανοσολογικής απόκρισης μεταξύ των δύο φυλών. Συνολικά, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η GS50 καταστέλλει αποτελεσματικά τις οξείες φλεγμονώδεις αποκρίσεις, στοχεύοντας κεντρικές φλεγμονώδεις οδούς που είναι κοινές σε διαφορετικούς ιστούς και για διαφορετικά φλεγμονώδη ερεθίσματα. Εκτός από την καταστολή της προφλεγμονώδους σηματοδότησης, η ικανότητά της να μειώνει την παραγωγή δραστικών ριζών οξυγόνου υποδηλώνει ότι η ρύθμιση του οξειδωτικού στρες συμβάλλει στον συνολικό μηχανισμό δράσης της GS50. Αυτό το διπλό προφίλ αντιφλεγμονώδους και αντιοξειδωτικής δράσης υποστηρίζει την περαιτέρω αξιολόγησή της ως υποψήφιας θεραπευτικής ένωσης για φλεγμονώδεις παθήσεις. Η GS32 αναγνωρίστηκε ως το πιο δραστικό αντικαρκινικό ανάλογο, με κυτταροτοξικότητα σε πολύ χαμηλές μικρομοριακές συγκεντρώσεις έναντι διαφόρων καρκινικών κυτταρικών σειρών ανθρώπου και ποντικού. Η GS32 επέδειξε επιλεκτικότητα έναντι των κακοήθων κυττάρων, και χαμηλή τοξικότητα προς τα φυσιολογικά ανοσοκύτταρα, υποδηλώνοντας ένα ευνοϊκό θεραπευτικό παράθυρο. Οι μηχανιστικές αναλύσεις κατέδειξαν ότι η GS32 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και επάγει απόπτωση κατά τρόπο δόσο- και χρόνο-εξαρτώμενο. Τα φαινόμενα αυτά συνοδεύτηκαν από στάση του κυτταρικού κύκλου στη φάση S, εύρημα συμβατό με παρεμβολές στη διαδικασία της αντιγραφής του DNA και των συναφών μηχανισμών ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η GS32 δεν επέδειξε αποκλειστικά κυτταροστατική δράση, αλλά προήγαγε ενεργά τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο, υποδηλώνοντας την ενεργοποίηση ενδογενών μηχανισμών απόκρισης στο κυτταρικό στρες. Η ανάλυση του κινόματος αποκάλυψε ότι η έκθεση στο ανάλογο GS32 οδήγησε σε συντονισμένη τροποποίηση πολλαπλών σηματοδοτικών μονοπατιών. Παρατηρήθηκε καταστολή διάφορων κινασών σερίνης/θρεονίνης και αύξηση της δραστικότητας βασικών κινασών τυροσίνης, οδηγώντας σε ευρύτερο επαναπρογραμματισμό των μονοπατιών που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, τη φλεγμονή και τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Οι αναλύσεις σε επίπεδο δικτύων υποστήριξαν την ερμηνεία ότι οι μεταβολές αυτές αντανακλούν αποκρίσεις διασυνδεδεμένων μονοπατιών και δεν είναι αποτέλεσμα τροποποίησης της δραστικότητας μεμονωμένων κινασών. Η αντικαρκινική δράση της GS32 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω σε in vivo μοντέλα μελανώματος και καρκίνου του παχέος εντέρου, όπου η θεραπεία με GS32 επιβράδυνε την ανάπτυξη του όγκου χωρίς ενδείξεις συστημικής τοξικότητας. Πέραν των άμεσων επιδράσεών της στα καρκινικά κύτταρα, η GS32 επηρέασε το μικροπεριβάλλον του όγκου αυξάνοντας τόσο τη διήθησή του από ανοσοκύτταρα όσο και την ενεργοποίηση των ανοσοκυττάρων. Οι ex vivo λειτουργικές δοκιμασίες κατέδειξαν αύξηση της κυτταροτοξικής δραστικότητας των Τ λεμφοκυττάρων και των φυσικών φονικών κυττάρων μετά από θεραπεία με GS32, υποδεικνύοντας ότι η GS32 συμβάλλει στην αντικαρκινική ανοσία παράλληλα με την άμεση κυτταροτοξική της δράση. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η GS32 δρα έναντι του όγκου τόσο μέσω ενδογενών μηχανισμών του όγκου όσο και μέσω ανοσομεσολαβούμενων μηχανισμών. Σε μελέτες συνδυαστικής χορήγησης της GS32 με αναστολείς των ανοσολογικών σημείων ελέγχου παρουσιάστηκαν βελτιωμένα αποτελέσματα, υποδηλώνοντας ότι η GS32 μπορεί να ενισχύσει την ανταπόκριση του όγκου στην ανοσοθεραπεία, όπως τεκμηριώνεται από την επιβράδυνση της ανάπτυξης του όγκου και την αυξημένη διήθηση του μικροπεριβάλλοντος από ανοσοκύτταρα. Συλλογικά, αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι η GS32 ασκεί ισχυρή αντικαρκινική δράση μέσω ενός διπλού μηχανισμού που περιλαμβάνει άμεση κυτταροτοξικότητα έναντι των καρκινικών κυττάρων και έμμεσα μέσω τροποποίησης της αντικαρκινικής ανοσολογικής απόκρισης. Επάγοντας στάση κατά τη φάση S και απόπτωση, η GS32 διαταράσσει βασικές οδούς πολλαπλασιασμού και επιβίωσης στα καρκινικά κύτταρα, ένα αποτέλεσμα που υποστηρίζεται από τον συντονισμένο επαναπρογραμματισμό του κινόματος σε επίπεδο δικτύων. Η αποτελεσματικότητά της σε συγγενικά μοντέλα όγκων, η απουσία συστηματικής τοξικότητας και η ικανότητά της να ενισχύει τη διήθηση των όγκων από ανοσοκύτταρα και την κυτταροτοξική λειτουργία των ανοσοκυττάρων, ενισχύουν περαιτέρω το θεραπευτικό της δυναμικό. Επιπλέον, τα βελτιωμένα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν σε συνδυασμό με τους αναστολείς σημείων ελέγχου του ανοσοποιητικού συστήματος υποδηλώνουν ότι η GS32 μπορεί να ευαισθητοποιήσει τους όγκους στην ανοσοθεραπεία. Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν την GS32 ως έναν πολλά υποσχόμενο υποψήφιο αντικαρκινικό παράγοντα που δρα τόσο μέσω εγγενών στον όγκο όσο και ανοσομεσολαβούμενων μηχανισμών δράσης. Συμπερασματικά, η παρούσα διατριβή παρουσιάζει μια ολοκληρωμένη προκλινική αξιολόγηση ημισυνθετικών αναλόγων πολυφαινολών που προέρχονται από την ελιά, και καταδεικνύει ότι ο ορθολογικός δομικός σχεδιασμός τους μπορεί να ενισχύσει σημαντικά τη βιολογική δραστικότητά τους. Οι GS50 και GS32 αναδείχθηκαν ως κύρια ανάλογα με διακριτά αλλά συμπληρωματικά προφίλ, που στοχεύουν αντίστοιχα φλεγμονώδεις και ογκογόνες διεργασίες. Η GS50 δρα ως ρυθμιστής οξέων φλεγμονωδών αποκρίσεων, ενώ η GS32 επιδεικνύει ισχυρή αντικαρκινική δράση μέσω ενός συνδυασμού κυτταροτοξικών και ανοσοτροποποιητικών μηχανισμών, αποτελέσματα που υποστηρίζουν την περαιτέρω διερεύνησή τους ως υποψήφιους παράγοντες για μεταφραστική αξιοποίηση.