Διερεύνηση του ρόλου των πρωτεϊνών του συμπλόκου RISC στην ανάπτυξη ηπατικής παθολογίας, με έμφαση στο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα

Abstract

Post-transcriptional and translational control comprise two of the most important generegulation mechanisms in eukaryotic organisms. In recent years, the discovery of new RNA species, with various properties, has significantly advanced our understanding of gene-expression regulation and cell signaling. To fulfill its role in the cell, RNA interacts with RNA-binding proteins (RBPs), forming complexes that facilitate key-cellular processes, such as cell differentiation, embryonic development and gene silencing. A major RNA/protein complex is RISC (RNA-induced silencing complex), which plays a crucial role in the RNA interference (RNAi) mechanism, a central posttranscriptional regulatory process. RISC consists of various proteins, such as the Argonautes (AGOs), DICER, TRBP2 and PACT. However, recent studies have highlighted new, fascinating, functions of these RNAi proteins in cellular processes, like cell division and DNA-damage repair. In the present study, using various experimental technologies methods, especially immunofluorescence and confocal laser scanning microscopy (high resolution), we investigated the role(s) of RISC proteins in local-homeostasis regulation, as well as the molecular mechanisms through which they are controlled, in both normal and pathological settings. Our results revealed novel, hitherto unknown, roles of TRBP2 and AGO2 proteins in cell-cycle regulation and cell division, two vital processes for proper-organism function. Specifically, TRBP2 expression was found to be tightly regulated during mitosis, a functional coupling that is not related to TRBP2 major role in RNAi mechanism, as it is evidenced by the different expression pattern of its co-factor, the PACT protein. This phenotype is also independent of oncogenic characteristics, metastatic potential, or molecular signature of cells, while in silico analysis indicates strong interaction potential between TRBP2 and other cell-cycle regulators, thus highlighting TRBP2 as a novel, and pivotal, molecule, for cell-growth control. Importantly, AGO2 was shown to play a key role in centrosome biosynthesis and mitoticspindle formation, both in “normal” and liver-cancer cells, with its co-localization with main centrosomal proteins further strengthening its importance in these mechanisms and processes. Our results strongly suggest for a non-canonical, microtubule network-dependent, RNAi mechanism, which tightly regulates local homeostasis, especially during cell division. Furthermore, examination of protein DROSHA, known for its role in miRNA biogenesis pathway, unveiled novel, possibly miRNA-independent, functions in Golgi apparatus. Notably, the strong correlation between DROSHA localization at Golgi apparatus and cancer phenotype, malignancy grade or/and metastatic status/dynamics indicates DROSHA involvement in invasionand metastasis of cancer cells. These results inform that DROSHA is likely engaged in the commencement and advancement of malignancies, via structural or/and functional alterations of Golgi apparatus. Taken together, the discovery of novel, hitherto unknown, non-canonical, functions of the above RNAi machinery-related proteins may constitute a springboard, for better understanding, and strongly illuminating, the molecular basis of several pathological conditions, including cancer, in humans, thereby, consequently leading to prompt development of targeted, and highly effective therapies, in the clinical practice, the years to come.

Οι έλεγχοι της μετα-μεταγραφικής και της μεταφραστικής πρωτεϊνικής μηχανής αποτελούν δύο από τους σημαντικότερους τρόπους ρύθμισης της έκφρασης των γονιδίων στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Τα τελευταία χρόνια, η ανακάλυψη νέων ειδών RNA, με ποικίλες ιδιότητες, έχουν συμβάλλει καθοριστικά στην κατανόηση της ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και σηματοδότησης μέσα στο κύτταρο. Για τη διεκπεραίωση του κυτταρικού ρόλου του, το RNA αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες που προσδένονται σε αυτό (RNA-binding proteins – RBPs), σχηματίζοντας σύμπλοκα που μετέχουν και υπαγορεύουν την επιτυχή διεξαγωγή πολλαπλών και ιδιαίτερων κυτταρικών διεργασιών, λειτουργιών και φαινομένων, όπως η κυτταρική διαφοροποίηση, η εμβρυϊκή ανάπτυξη και η αποσιώπηση γονιδίων. Ένα τέτοιο σύμπλοκο, RNA/πρωτεϊνών, αποτελεί το RISC (RNAinduced silencing complex), με καθοριστική δράση στον RNAi (RNA interference) μηχανισμό, ο οποίος κατέχει κεντρικό ρόλο στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση. Το RISC αποτελείται από διαφορετικές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένης της οικογένειας των Αργοναυτών (Argonautes – AGOs), αλλά και των πρωτεϊνών DICER, TRBP2 και PACT. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει νέες συναρπαστικές λειτουργίες των πρωτεϊνών του RNAi μηχανισμού, με τις ίδιες να εμπλέκονται σε πολλαπλές κυτταρικές διεργασίες, όπως η κυτταρική διαίρεση ή η επιδιόρθωση βλαβών του DNA. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή, μέσω της εφαρμογής ποικίλων πειραματικών τεχνολογιών και διαδικασιών, με έμφαση στον ανοσοφθορισμό και τη μικροσκοπία φθορισμού, διερευνήθηκε ο ρόλος των RISC πρωτεϊνών στη ρύθμιση της τοπικής ομοιόστασης, καθώς και οι μοριακοί μηχανισμοί δράσης αυτών, τόσο σε φυσιολογικά όσο και σε παθολογικά περιβάλλοντα. Τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν νέους, άγνωστους μέχρι σήμερα, ρόλους των πρωτεϊνών TRBP2 και AGO2 στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και την κυτταρική διαίρεση, δύο κρίσιμες διαδικασίες για τη φυσιολογική λειτουργία των οργανισμών. Πιο συγκεκριμένα, η έκφραση της πρωτεΐνης TRBP2 βρέθηκε να υπόκειται σε αυστηρή ρύθμιση κατά τη διάρκεια της μίτωσης, γεγονός που δε φαίνεται να σχετίζεται με τη βασική λειτουργία της πρωτεΐνης στον RNAi μηχανισμό, κρίνοντας από τις διαφορές που παρατηρούνται στο προφίλ έκφρασης του θεμελιώδους συμπαράγοντα της TRBP2, της πρωτεΐνης PACT. Επιπλέον, ο συγκεκριμένος φαινότυπος δεν επηρεάζεται από την ύπαρξη ογκογόνων χαρακτηριστικών, μεταστατικού δυναμικού ή/και μοριακής υπογραφής των κυττάρων, ενώ in silico προσεγγίσεις υποστηρίζουν ισχυρό δυναμικό αλληλεπίδρασης της TRBP2 με βασικές πρωτεΐνες-ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου, αναδεικνύοντας την TRBP2 ως ένα νέο μόριο, με κεντρική θέση στη ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης και ανάπτυξης. Από την άλλη μεριά, η πρωτεΐνη AGO2 δείχθηκε να κατέχει ουσιώδη ρόλο στη βιοσύνθεση των κεντροσωμάτων και το σχηματισμό της μιτωτικής ατράκτου, τόσο σε φυσιολογικά όσο και σε καρκινικά ηπατικά κύτταρα, με το συνεντοπισμό της με βασικές κεντροσωμικές πρωτεΐνες να ενισχύει τη σημασία της για την ορθή λειτουργία των δομών αυτών. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν την ύπαρξη ενός μη-κανονικού, εξαρτώμενου από το δίκτυο των μικροσωληνίσκων, RNAi μηχανισμού, ο οποίος ρυθμίζει την τοπική ομοιόσταση, ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης. Επιπρόσθετα, ο έλεγχος της πρωτεΐνης DROSHA, η οποία συμμετέχει στο μονοπάτι βιογένεσης των miRNAs, έδειξε πιθανές, νέες, miRNA-ανεξάρτητες, λειτουργίες της πρωτεΐνης στο σύμπλεγμα Golgi. Ιδιαίτερης σημασίας είναι η ισχυρή συσχέτιση της πρωτεϊνικής τοπολογίας της DROSHA στο σύμπλεγμα Golgi με τον καρκινικό φαινότυπο, το βαθμό κακοήθειας και τα μεταστατικά χαρακτηριστικά, γεγονός που υποδεικνύει την εμπλοκή της στη διήθηση και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων, στον άνθρωπο. Συνεπώς, τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν έναν καινοφανή ρόλο της πρωτεΐνης DROSHA στην εμφάνιση και εξέλιξη του όγκου, μέσω δομικού ή/και λειτουργικού ελέγχου που αυτή μπορεί να ασκεί στο σύμπλεγμα Golgi. Συμπερασματικά, η ανακάλυψη νέων, αγνώστων μέχρι σήμερα, λειτουργιών των παραπάνω πρωτεϊνών μπορεί να αποτελέσει εφαλτήριο βήμα για την καλύτερη κατανόηση του μοριακού υποβάθρου διαφόρων παθολογικών καταστάσεων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου στον άνθρωπο, και, συνεπώς, να οδηγήσει στην ανάπτυξη στοχευμένων και καινοτόμων θεραπειών, στην κλινική πράξη.