Μελέτη των ρυθμιστικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ IncRNA και μεταγραφικών παραγόντων στον καρκίνο

Abstract

Gastric cancer (GC) remains one of the most lethal malignancies worldwide, with its poor prognosis largely attributed to late diagnosis and the high metastatic potential of the disease at advanced stages. In this context, increasing attention has been directed toward lineage-survival transcription factors (LS-TFs) as potential sources of tissue-specific biomarkers, given their role in regulating cellular identity during the morphogenesis of the gastrointestinal tract. In gastric cancer, LS-TFs such as GATA4 and GATA6 frequently undergo genomic amplification and participate in oncogenic transcriptional networks. However, due to their extensive physiological roles across multiple tissues, their direct exploitation as diagnostic or therapeutic targets remains limited, shifting attention toward the investigation of their downstream gene targets. In this study, GATA-dependent transcriptional regulation was mapped in gastric cancer cells using inducible RNAi-mediated gene silencing systems in combination with transcriptomic RNA-seq analysis, revealing the oncogenic role of GATA4 and GATA6. Complementary analysis of chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) data revealed their cancer-associated regulatory potential. This combined experimental and computational approach revealed that GATA factors regulate the expression of numerous coding and non-coding RNAs involved in key oncogenic processes, including cell cycle progression, apoptosis, ferroptosis, and oxidative stress response. Particular emphasis was placed on long non-coding RNAs (lncRNAs), which exhibit high tissue specificity and cancer-associated functions and may serve as promising biomarkers. One of the GATA-regulated lncRNAs, termed RECUR1, was further investigated in gastric cancer cells through a combination of transcriptomic and experimental approaches. For its functional characterization, inducible RNAi-mediated silencing, CRISPR interference and overexpression strategies, as well as endogenous genome editing using CRISPR nickase, were employed, enabling the independent investigation of both the RECUR1 transcript and its promoter as a cis-regulatory element. These findings revealed an oncogenic role for RECUR1, which is negatively regulated by GATA transcription factors and involved in apoptosis regulation. Furthermore, the RECUR1 promoter was shown to exert cis-regulatory control over the expression of the adjacent gene CPR, while targeted perturbation of this promoter resulted in a pronounced oncogenic phenotype. Further investigation of the RECUR1 promoter revealed a regulatory SNP, with the alternative allele associated with increased tumor aggressiveness, highlighting its potential clinical relevance. Finally, within a broader omics-based approach to identify novel anticancer strategies, the activity of an extract derived from the marine macroalga Hypnea musciformis was examined in liver and colorectal cancer cells using transcriptomic and proteomic analyses. The extract induced a p53-mediated response in liver cancer cells, whereas in colorectal cancer cells it primarily triggered metabolic alterations, highlighting its differential anticancer activity. Overall, this study provides a comprehensive and multi-level investigation of gastrointestinal malignancies, identifying cancer-associated lncRNA targets with diagnostic and prognostic potential while also exploring alternative chemopreventive strategies

Ο γαστρικός καρκίνος (GC) αποτελεί μία από τις πλέον θανατηφόρες κακοήθειες παγκοσμίως, με τη δυσμενή του πρόγνωση να αποδίδεται κυρίως στην καθυστερημένη διάγνωση και στον έντονα μεταστατικό χαρακτήρα της νόσου σε προχωρημένα στάδια. Στο πλαίσιο της αναζήτησης νέων βιοδεικτών, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι μεταγραφικοί παράγοντες διατήρησης κυτταρικής γενεαλογίας (Lineage Survival Transcription Factors, LS-TFs), οι οποίοι ρυθμίζουν τις κυτταρικές ταυτότητες κατά τη μορφογένεση του γαστρεντερικού συστήματος. Στον γαστρικό καρκίνο, LS-TFs όπως οι GATA4 και GATA6 απαντώνται σε πολλαπλά αντίγραφα στο καρκινικό γονιδίωμα και συμμετέχουν σε ογκογόνα μεταγραφικά δίκτυα. Ωστόσο, λόγω της εκτεταμένης φυσιολογικής τους δράσης σε πολλούς ιστούς, δεν μπορούν να αξιοποιηθούν διαγνωστικά/θεραπευτικά, και το ενδιαφέρον στρέφεται στη μελέτη των γονιδίων-στόχων τους. Στην παρούσα μελέτη χαρτογραφήθηκε η GATA-εξαρτώμενη μεταγραφική ρύθμιση σε κύτταρα γαστρικού καρκίνου, μέσω συστημάτων επαγόμενης RNAi σίγησης σε συνδυασμό με μεταγραφωμικές αναλύσεις RNA-seq, οι οποίες ανέδειξαν τον ογκογόνο ρόλο των GATA4/6. Παράλληλα, με ανάλυση δεδομένων ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (ChIP-seq), αποτυπώθηκε το καρκινοειδικό ρυθμιστικό τους δυναμικό. Η συνδυαστική πειραματική και υπολογιστική προσέγγιση κατέδειξε ότι οι GATA παράγοντες ρυθμίζουν την έκφραση πλήθους κωδικοποιητικών και μη κωδικοποιητικών RNAs, τα οποία μεσολαβούν σε βασικές ογκοεπαγωγικές διεργασίες, όπως ο κυτταρικός κύκλος, η απόπτωση, η φερρόπτωση και η απόκριση στο οξειδωτικό στρες. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στα μακρά μη κωδικοποιητικά RNAs (lncRNAs), τα οποία εμφανίζουν υψηλή ιστοειδική και καρκινοειδική λειτουργία και μπορούν να αξιοποιηθούν ως δυνητικοί βιοδείκτες. Ένα από τα GATA-ρυθμιζόμενα lncRNAs, το οποίο ονομάστηκε RECUR1, μελετήθηκε σε κύτταρα γαστρικού καρκίνου μέσω συνδυασμού μεταγραφωμικών και πειραματικών προσεγγίσεων. Για τον λειτουργικό χαρακτηρισμό του RECUR1 αξιοποιήθηκαν συστήματα επαγόμενης RNAi σίγησης, CRISPR καταστολής και υπερέκφρασης, καθώς και ενδογενούς γονιδιωματικής τροποποίησης (CRISPR nickase), επιτρέποντας τη διακριτή μελέτη τόσο του μεταγράφου RECUR1 όσο και του υποκινητή του ως cis-ρυθμιστικού στοιχείου. Τα αποτελέσματα αυτά ανέδειξαν τον ογκογόνο ρόλο του RECUR1, το οποίο τελεί υπό κατασταλτικό έλεγχο από τους μεταγραφικούς παράγοντες GATA και εμπλέκεται στη ρύθμιση αποπτωτικών διεργασιών. Παράλληλα, καταδείχθηκε ότι ο RECUR1 υποκινητής ασκεί cis-ρυθμιστική δράση στην έκφραση του γειτονικού γονιδίου CPR, ενώ η στοχευμένη τροποποίησή του οδηγεί σε ισχυρό ογκοεπαγωγικό φαινότυπο. Η περαιτέρω διερεύνηση του RECUR1 υποκινητή αποκάλυψε την παρουσία ενός λειτουργικά σημαντικού SNP, του οποίου το εναλλακτικό αλληλόμορφο συσχετίζεται με αυξημένη επιθετικότητα, υπογραμμίζοντας τη δυνητική κλινική του σημασία. Τέλος, στο πλαίσιο μιας ευρύτερης ομικής προσέγγισης για την αναζήτηση αντικαρκινικών στρατηγικών, μελετήθηκε η δράση εκχυλίσματος του θαλάσσιου μακροφύκους Hypnea musciformis σε καρκινικά κύτταρα ήπατος και εντέρου μέσω μεταγραφωμικής και πρωτεωμικής ανάλυσης. Το εκχύλισμα ενεργοποίησε απόκριση διαμεσολαβούμενη από το p53 σε καρκινικά κύτταρα ήπατος, ενώ στα κύτταρα παχέος εντέρου παρατηρήθηκαν κυρίως μεταβολικές μεταβολές, αναδεικνύοντας τη διαφοροποιημένη αντικαρκινική του δράση. Συνολικά, η παρούσα μελέτη προσφέρει μια ολοκληρωμένη και πολυεπίπεδη προσέγγιση στη μελέτη νεοπλασιών γαστρεντερικής προέλευσης, αναδεικνύοντας τόσο καρκινοειδικούς lncRNA στόχους με διαγνωστικό/προγνωστικό δυναμικό, όσο και εναλλακτικές στρατηγικές χημειοπροφύλαξης.