Μελέτη του ρόλου των λιποπρωτεϊνών στη διαμόρφωση και λειτουργία του μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών σε πειραματικά μοντέλα ζώων

Abstract

Introduction: In recent years, an important part of bone research has been focused on the study of the relationship between lipid metabolism and bone marrow cells function. In this, has contributed the progress in the identification of the cellular components of the bone marrow niches. Towards this direction, we have recently documented that the deficiency of Apolipoprotein A1 (APOA-Ι), a cardinal molecule in the biogenesis of HDL, causes decreased osteoblastic and increased lipoblastic function, disrupting the homeostasis of bone microenvironment. In addition, our laboratory experiments have shown that the lack of APOE, in combination with the western-type diet (WTD), causes osteoporosis. Several studies indicate that apolipoprotein E affects bone metabolism in combination with the type of food given (regular or high-fat). Lipidated APOE, which is found in chylomicron remnants but also in other lipoproteins, is recognized by the LDL receptor (LDLR). Experimental data suggest the involvement of LDLR in skeletal development. However, the effect of LDLR on bone metabolism has been poorly studied and with controversial results.Based on current knowledge and the findings of our laboratory, in the present study we investigated whether LDL receptor deficiency and APOE deficiency (in combination with a high-fat diet) affect the relationship between lipid and bone metabolism. Material and Methods: We used LDLR deficient (Ldlr-/-) mice were fed with normal diet (chow diet) and APOE deficient (ApoE-/-) mice were fed with standard western-type diet (WTD) for 24 weeks. Additionally, as a control animals we used wild type (C57BL/6) mice were fed with chow diet or WTD respectively.Two and seven days before euthanasia calcein was injected intraperitonealy for the determination of new bone formation rate. Following sacrifice, tibia and femora were removed and were used for histological and histomorphometrical analyses. In the tissue sections we perfomed histological (H&E) and histochemical (TRAP) analyses. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) were isolated from mice femora and then assessed for the expression of the osteoblastic (Runx2, OSX, Wnt/b-catenin pathway, SOST, CXCR4/CXCL12/ANXA2 axis and MAPK1/PI3K/AKT axis), osteoclastic (OPG, RANKL, OPG/RANKL, RANK, TRAP, cathepsin K) and lipoblastic (PPARγ, CEBPa, Angptl-4 and brown adipose tissue markers Dio2, UCP1) regulators using Western Blotting and RT-PCR.Results: A. Ldlr-/- chow diet mice1) In the bone marrow of Ldlr-/ mice was observed increased bone formation rate and increased number of adipocytes, in contrast to the control mice. 2) BMMSCs from Ldlr-/- mice display elevated Runx2 expression levels (at both protein and mRNA) and increased OSX levels compared to the control group. Furthermore, mRNA expression levels of basic components of canonical Wnt/b-catenin pathway (such as Wnt3a, b-catenin and LPR5), were increased in Ldlr-/- mice compared to the C57BL/6 mice. No significant differences were observed in the expression of CXCR4/CXCL12/ANXA2 and MAPK1/PI3K/AKT axis between the two test groups of animals. 3) The expression levels of regulators of osteoclastic function RANK, RANKL and cathepsin K, were elevated in Ldlr-/- mice compared to C57BL/6 mice. In contrast, the gene expression levels of the ratio OPG / RANKL, were reduced in Ldlr-/- mice. 4) The expression of the major lipoblastic regulator PPARγ was significantly increased in Ldlr-/- mice compared to their WT counterparts. The other key regulator of lipogenesis CEBPa, was increased in ApoE-/- mice compared to the control mice. Additionally, the expression levels of Angplt-4, which is a central regulator of lipid metabolism, were significantly elevated in Ldlr-/-mice. In the other hand, the expression levels of brown adipose tissue markers Dio2, UCP1 were reduced in Ldlr-/-mice in contrast to the control mice. Conclusions: 1) LDLR deficiency, regulates MSC differentiation at early stages, thus its absence affects both the osteoblastic and lipoblastic differentiation. 2) The absence of LDLR is implicated in the regulation of osteoblast function and most likely also affects the osteoclastic function and consequently the configuration and function of bone marrow microenvironment. 3) Lack of the LDL receptor has a positive effect on bone metabolism because osteoblastic function predominates over osteoclastic function. 4) The absence of LDLR is implicated in the function of osteoblasts, osteoclasts and lipoblasts. The changes that observed in the configuration and function of the bone marrow microenvironment are likely to affect the establishment, development and progression of bone metastases.B. ApoE-/- WTD mice1) A complete absence of adipocytes was observed in the bone marrow of ApoE-/- WTD mice in contrast to C57BL/6 WTD animals that bone marrow was rich in adipocytes.2) Osteoclast number was significantly increased, while bone synthesis was significantly reduced in ApoE-/- compared to the C57BL/6 mice that consumed WTD. 3) BMMSCs from ApoE-/- WTD mice displayed significantly reduced OSX mRNA expression levels compared to the control group. 4) The mRNA expression levels of basic components of canonical Wnt/b-catenin pathway (such as Wnt3a, b-catenin and LPR5), were significantly reduced in ApoE-/- WTD mice compared to the C57BL/6 WTD mice. Furthermore, the expression levels of SOST (antagonist of Wnt signaling pathway) were significantly reduced in ApoE-/- WTD mice, in contrast to the control mice. 5) The expression levels of CXCR4/CXCL12/ANXA2 and MAPK1/PI3K/AKT axis, that involved in osteoblastic function, were significantly reduced in ApoE-/- WTD mice. 6) The expression of cathepsin k, the key regulator of osteoclastic function, was elevated in ApoE-/- WTD mice compared to C57BL/6 WTD mice. In contrast, the gene expression levels of CEBPa and Angptl-4, that involved in lipogenesis, were reduced in ApoE-/- WTD mice. Conclusions: 1) Apolipoprotein E is implicated in the regulation of osteoblast and osteoclasts function and prevents BM adipocity after the consumption of WTD. 2) APOE deficiency, regulates MSC differentiation at early stages, so its absence affects both the osteoblastic and lipoblastic differentiation, after the consumption of high fat diet. 3) The lack of APOE, in combination with the consumption of Western Type Diet, causes a disruption of the CXCL12/CXCR4 axis and consequently in the modification of the bone marrow microenvironment. 4) The absence of APOE after the consumption of WTD, is implicated in the function of osteoblasts, osteoclasts and lipoblasts. The changes that observed in the configuration and function of the bone marrow microenvironment are likely to affect the establishment, development and progression of bone metastases.

Εισαγωγή: Τα τελευταία χρόνια, σημαντικό μέρος της έρευνας στα οστά έχει επικεντρωθεί στη μελέτη της σχέσης μεταξύ του μεταβολισμού των λιπιδίων και της λειτουργίας των κυττάρων του μυελού των οστών. Σε αυτό, έχει συμβάλει η πρόοδος που έχει σημειωθεί στον προσδιορισμό των κυτταρικών συστατικών των φωλεών του μυελού. Σε αυτή την κατεύθυνση, πειράματα του εργαστηρίου μας έδειξαν πως η ανεπάρκεια της απολιποπρωτεΐνης ΑI (ΑPOΑ-Ι), του κύριου ρυθμιστή της βιοσύνθεσης της λιποπρωτεΐνης υψηλής πυκνότητας (HDL), οδήγησε σε μείωση της οστεοβλαστικής κι αύξηση της λιποβλαστικής λειτουργίας των οστών, διαταράσσοντας την ομοιόσταση του μικροπεριβάλλοντος τους. Επιπλέον, πειράματά μας σε ποντίκια έδειξαν πως η έλλειψη της απολιποπρωτεΐνης Ε (APOE), σε συνδυασμό με τη χορήγηση τροφής πλούσια σε λιπαρά, προκαλεί οστεοπόρωση.Αρκετές μελέτες υποδεικνύουν ότι η απολιποπρωτεΐνη Ε επηρεάζει τον μεταβολισμό των οστών σε συνδυασμό με το είδος της χορηγούμενης τροφής (κανονικής ή πλούσιας σε λιπαρά). Η λιπιδιωμένη APOE, η οποία βρίσκεται στα υπολείμματα χυλομικρών αλλά και σε άλλες λιποπρωτεΐνες, αναγνωρίζεται από τον υποδοχέα της LDL (LDLR). Πειραματικά δεδομένα προτείνουν την συμμετοχή του LDLR στην ανάπτυξη του σκελετού. Ωστόσο, η επίδραση του LDLR στον μεταβολισμό των οστών έχει μελετηθεί ελάχιστα και με αμφιλεγόμενα αποτελέσματα. Στηριζόμενοι στην παρούσα γνώση και στα ευρήματα του εργαστηρίου μας, διερευνήσαμε κατά πόσο η έλλειψη του υποδοχέα της LDL και η έλλειψη της APOE (σε συνδυασμό της τελευταίας με τη χορήγηση δίαιτας πλούσιας σε λιπαρά) επιδρούν στη σχέση μεταξύ του λιπιδικού και οστικού μεταβολισμού. Μεθοδολογία: Για τον παραπάνω σκοπό, χρησιμοποιήσαμε μοντέλα ποντικιών με έλλειψη του γονιδίου του Ldlr που τους χορηγήθηκε κανονική τροφή (chow diet) καθώς και ποντίκια με έλλειψη του γονιδίου της ApoE που τράφηκαν με δίαιτα δυτικού τύπου πλούσια σε λιπαρά (WTD) για 24 εβδομάδες. Επίσης, ως control ζώα χρησιμοποιήσαμε ποντίκια άγριου τύπου (C57BL/6) που τους χορηγήθηκε είτε chow diet είτε WTD αντίστοιχα. Η διερεύνηση των στόχων της παρούσας εργασίας πραγματοποιήθηκε με την εφαρμογή μοριακών, ιστολογικών και ιστομορφομετρικών μεθοδολογιών. Δύο και επτά ημέρες προ της ευθανασίας πραγματοποιήθηκε ενδοπεριτοναϊκή ένεση καλσεΐνης. Μετά την θυσία των ζώων, απομονώθηκαν χειρουργικά τα μηριαία οστά και οι κνήμες και έγιναν ιστολογικές και ιστομορφομετρικές αναλύσεις. Με τη χρώση TRAP και την εναπόθεση καλσεΐνης (δυναμική ιστομορφομετρία) ελέγχθηκε η οστική αποδόμηση και ο ρυθμός σύνθεσης νεοσχηματιζόμενου οστού, αντίστοιχα. Επιπλέον, μεσεγχυματικά κύτταρα του μυελού των οστών (BMMSC) απομονώθηκαν από το μηριαίο οστό των πειραματόζωων και καλλιεργήθηκαν με σκοπό την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, μορίων και σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται στην οστεοβλαστική λειτουργία [(RUNX2, Osterix (OSX), Wnt/b-catenin κανονικό μονοπάτι, του ανταγωνιστή SOST του μονοπατιού WNT, του άξονα CXCR4/CXCL12/ANXA 2 και του μεταγωγικού άξονα MAPK1/PI3K/AKT], στην οστεοκλαστική λειτουργία [osteprotegerin (OPG), RANK-Ligand (RANKL), λόγος OPG/RANKL, RANK, TRAP, cathepsin Κ] καθώς και στην λιπογένεση [(PPARγ, CEBPa, αγγειοποιητίνη-4 (Angptl-4) και των δεικτών καφέ λιπώδους ιστού Dio2, UCP1)]. Για την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης των πρωτεϊνών, χρησιμοποιήσαμε τη μοριακή τεχνική Western Blot ενώ για την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης του mRNA χρησιμοποιήσαμε τη RT-PCR. Αποτελέσματα: A. Ldlr-/- chow diet ποντίκια 1) Στον μυελό των οστών των Ldlr-/- ποντικιών παρατηρήθηκε αυξημένος αριθμών οστεοδοκίδων και λιποκυττάρων σε σχέση με τα C57BL/6 ποντίκια. 2) Τα Ldlr-/- ποντίκια, εμφάνισαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης των ρυθμιστών της οστεοβλαστογένεσης RUNX2 (τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA) και OSX συγκρινόμενα με τα C57BL/6 ζώα. Επίσης, τα επίπεδα έκφρασης βασικών συστατικών της Wnt/b-catenin σηματοδότησης (όπως Wnt3a, b-catenin και LRP5) η οποία επάγει την οστεοβλαστική λειτουργία, ήταν αυξημένα στα Ldlr-/ -ποντίκια συγκρινόμενα με την ομάδα ελέγχου. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην έκφραση των μεταγωγικών αξόνων CXCR4/CXCL12/ANXA2 και MAPK1/PI3K/AKT, που ενέχονται στην οστεοβλαστική λειτουργία, μεταξύ των δύο υπό εξέταση ομάδων ζώων. 3) Τα επίπεδα έκφρασης των ρυθμιστών της οστεοκλαστικής λειτουργίας RANK, RANKL και cathepsin K ήταν αυξημένα στα Ldlr-/- ποντίκια σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Αντίθετα, τα επίπεδα έκφρασης της αναλογίας OPG/RANKL ήταν μειωμένα στα Ldlr-/- ποντίκια. 4) Ο βασικός ρυθμιστής της λιπογένεσης PPARγ, τόσο σε επίπεδο πρωτεΐνης όσο και σε επίπεδο mRNA, ήταν σημαντικά αυξημένος στα Ldlr-/- ποντίκια συγκρινόμενα με τα C57BL/6 ποντίκια. Η έκφραση του ετέρου βασικού ρυθμιστή της λιπογένεσης CEBPa, παρουσίασε ισχυρή τάση αύξησης στα Ldlr-/-ποντίκια. Επίσης, η έκφραση της Angptl-4, η οποία αποτελεί κεντρικό ρυθμιστή του μεταβολισμού των λιπιδίων, παρουσίασε σημαντική αύξηση στα Ldlr-/-ποντίκια σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Αντίθετα, οι δείκτες του καφέ λιπώδους ιστού Dio2 και UCP1, παρουσίασαν μειωμένη έκφραση στα Ldlr-/ -ποντίκια σε σχέση με τα control ζώα. Συμπεράσματα: 1) H έλλειψη του υποδοχέα της LDL ενεργοποιεί σε πρώιμο στάδιο τη μεσεγχυματική διαφοροποίηση επάγοντας τόσο την οστεοβλαστική όσο και την λιποβλαστική διαφοροποίηση. 2) H έλλειψη του LDLR διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της οστεοβλαστικής και πιθανόν της οστεοκλαστικής λειτουργίας και κατ’ επέκταση στη διαμόρφωση και λειτουργία του μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών. 3) H έλλειψη του LDLR έχει θετική επίδραση στον οστικό μεταβολισμό αφού υπερισχύει η οστεοβλαστική έναντι της οστεοκλαστικής λειτουργίας με αύξηση της οστικής μάζας στα Ldlr-/- σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. 4) Η έλλειψη του υποδοχέα της LDL επηρεάζει τη λειτουργία των λιποβλαστών του μυελού των οστών. Οι αλλαγές που παρατηρούνται στη διαμόρφωση και στη λειτουργία του μικροπεριβάλλοντος του μυελού, πιθανόν να επηρεάζουν την εγκατάσταση, την ανάπτυξη και την εξέλιξη των οστικών μεταστάσεων. B. ApoE-/- WTD ποντίκια 1) Στον μυελό των οστών των ApoE-/- WTD ποντικιών παρατηρήθηκε πλήρης απουσία λιποκυττάρων, σε αντίθεση με τα C57BL/6 WTD ζώα των οποίων ο μυελός των οστών ήταν πλούσιος σε λιποκύτταρα. 2) Ο αριθμός των οστεοκλαστών ήταν σημαντικά αυξημένος, ενώ των οστεοβλαστών σημαντικά ελαττωμένος στα ApoE-/- WTD πειραματόζωα σε σύγκριση με τα C57BL/6 WTD. 3) Τα ApoE-/- WTD ποντίκια, εμφάνισαν σημαντικά μειωμένα επίπεδα έκφρασης του ρυθμιστή της οστεοβλαστογένεσης OSX 4) Τα επίπεδα έκφρασης βασικών συστατικών της Wnt/b-catenin σηματοδότισης (όπως Wnt3a, b-catenin και LRP5) ήταν μειωμένα στα ApoE-/- WTD ποντίκια συγκρινόμενα με την ομάδα ελέγχου. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης του SOST, ισχυρού ανταγωνιστή του μονοπατιού WNT, βρέθηκαν σημαντικά ελαττωμένα στα ApoE-/- WTD ποντίκια σε σχέση με τα C57BL/6 WTD ζώα. 5) Τα ApoE-/- WTD ποντίκια, παρουσίασαν σημαντική μείωση στην έκφραση των μορίων των μεταγωγικών αξόνων CXCR4/CXCL12/ANXA2 και MAPK1/PI3K/AKT, που ενέχονται στην οστεοβλαστική λειτουργία. 6) Τα επίπεδα έκφρασης της Cathepsin k, βασικού ρυθμιστή της οστεοκλαστικής λειτουργίας, ήταν σημαντικά αυξημένα στα ApoE-/- WTD ποντίκια. Αντίθετα, τα επίπεδα έκφρασης των CEBPa και Angptl-4 που εμπλέκονται στην λιπογένεση ήταν σημαντικά μειωμένα στα ApoE-/- WTD ποντίκια συγκρινόμενα με την ομάδα ελέγχου. Συμπεράσματα: 1) Η έλλειψη της APOE σε συνδυασμό με τη χορήγηση δίαιτας πλούσιας σε λιπαρά, τροποποιεί τη λειτουργία οστεοβλαστών και οστεοκλαστών και αναστέλλει την εναπόθεση λιποκυττάρων στον μυελό των οστών ποντικών 2) Η APOE φαίνεται να ρυθμίζει τη διαφοροποίηση των αρχέγονων μεσεγχυματικών κυττάρων, καθώς η έλλειψή της επηρεάζει τόσο την οστεοβλαστική όσο και την λιποβλαστική διαφοροποίηση, μετά από κατανάλωση δίαιτας δυτικού τύπου. 3) Η έλλειψη της APOE σε συνδυασμό με την χορήγηση κετογόνου δίαιτας (δίαιτας δυτικού τύπου), οδηγεί σε διαταραχή του άξονα CXCL12/CXCR4 και συνεπώς σε τροποποίηση του μικροπεριβάλλοντος του μυελού των οστών. 4) Η έλλειψη της απολιποπρωτεΐνης Ε, σε συνδυασμό με χορήγηση τροφής πλούσιας σε λιπαρά, επηρεάζουν τη διαμόρφωση και τη λειτουργία του μικροπεριβάλλοντος του μυελού και πιθανόν συμβάλουν στην εγκατάσταση, την ανάπτυξη και την εξέλιξη των οστικών μεταστάσεων.