Secretome and pathway analysis in stress induced disc degeneration in vitro

Abstract

Disc degeneration is a leading cause of chronic back pain and disability, resulting from the gradual deterioration of intervertebral discs. This degeneration triggers sterile inflammation, pain, and reduced mobility by disrupting the disc’s structural integrity. The study aimed to elucidate the extracellular and intracellular signaling events associated with disc degenerationby measuring the expression levels of various pro-inflammatory cytokines, chemokines, growth and neurotrophic factors, and matrix-degrading enzymes. To achieve this aim, Luminex-based immunoassays were utilized to quantify 73 extracellular proteins and 21 intracellular signaling molecules in human Nucleus Pulposus (NP) cells exposed to IL-1β,Pam2CSK4 (a Toll-Like Receptor 2/6 agonist), and hydrogen peroxide (H₂O₂). The results demonstrated that treatments with IL-1β and Pam2CSK4 significantly increased the expression of pro-inflammatory and matrix-degrading genes, including IL-8, IL-6, IL-1β,and MMP-3. In contrast, H₂O₂ had a minimal impact, showing no significant elevation in these genes and primarily reducing cell viability only at high concentrations. Further analysis using Luminex multiplexed antibody-based assays revealed that five key markers, namely IL-6, IL-8, GRO-α, ICAM1, and MMP7, were consistently upregulated in both monolayer and alginate cultures following stimulation with IL-1β and Pam2CSK4. Additionally, distinct differences in protein secretion profiles were observed between the different stimuli and culture conditions. Intracellular Phosphoproteomic analysis in monolayer cultures indicated that Pam2CSK4 and IL-1β stimulations elicited similar phosphorylation patterns, particularly of c-JUN, NF-kB, andIKBA, which are pivotal in inflammation-related pathways. These phosphorylated markerswere accompanied by the secretion of numerous inflammatory and matrix-degrading proteins, reinforcing the connection between these signaling pathways and disc degeneration. Conversely, H₂O₂ treatment did not significantly influence intracellular signaling pathways, aligning with its limited effect on gene expression. Overall, this study advances the understanding of molecular mechanisms driving discdegeneration by highlighting the role of specific inflammatory mediators and signalingpathways. The consistent upregulation of proteins like IL-6, IL-8, MMP7, ICAM1, and GRO-α across different culture conditions underscores their potential as therapeutic targets. Additionally, the identification of key phosphorylated proteins involved in inflammation provides further avenues for developing targeted interventions to mitigate disc degeneration and its associated symptoms.

Ο εκφυλισμός του μεσοσπονδύλιου δίσκου αποτελεί μια από τις κύριες αιτίες πόνου στη μέση, χρόνιας οσφυαλγίας και αναπηρίας. Η διαδικασία του εκφυλισμού προάγει την ενεργοποίηση ανοσολογικών μηχανισμών και οδηγεί σε φλεγμονή, πόνο και μειωμένη κινητικότητα, διαταράσσοντας τη δομική ακεραιότητα και τη λειτουργία των δίσκων. Η παρούσα μελέτη είχε ως στόχο την αποσαφήνιση των εξωκυτταρικών και ενδοκυτταρικών μονοπατιών σηματοδότησης που εμπλέκονται στον εκφυλισμό, μέσω έκθεσης ανθρωπίνων κυττάρων μεσοσπονδύλιου δίσκου σε καταβολικούς παράγοντες όπως IL-1β (μια προφλεγμονώδης κυτοκίνη), το Pam2CSK4 (αγωνιστής του υποδοχέα Toll 2/6) και το υπεροξείδιο του υδρογόνου, το οποίο σχετίζεται με το οξειδωτικό στρες. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με ανάλυση καταβολικών γονιδίων και με πολυπλεκτικές ανοσοδοκιμασίες Luminex, για την ποσοτικοποίηση 73 εξωκυτταρικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων προφλεγμονωδών κυτοκινών, χημειοκινών, αυξητικών νευροτροφικών παραγόντων και ενζύμων αποικοδόμησης της εξωκυττάριας μήτρας, καθώς και 21 ενδοκυτταρικών μορίων σηματοδότησης. Η διερεύνηση της ενεργοποίησης αυτών των μορίων επιτρέπει μια πιο ολοκληρωμένη κατανόηση των μηχανισμών που εμπλέκονται στον εκφυλισμό του μεσοσπονδύλιου δίσκου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκθεση σε IL-1β και Pam2CSK4 αύξησε σημαντικά την έκφραση προφλεγμονωδών γονιδίων και γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυμα αποικοδόμησης της εξωκυττάριας μήτρας, όπως τα IL-8, IL-6, IL-1β και MMP3. Αντίθετα, το H₂O₂ είχε περιορισμένη επίδραση, χωρίς να προκαλεί σημαντική αύξηση των παραπάνω γονιδίων, ενώ μείωσε τη βιωσιμότητα των κυττάρων μόνο σε υψηλές συγκεντρώσεις. Περαιτέρω ανάλυση με πολυπλεκτικές ανοσοδοκιμασίες Luminex αποκάλυψε ότι πέντε βασικοί πρωτεϊνικοί δείκτες, IL-6, IL-8, GROA, ICAM1 και MMP7, ήταν σταθερά αυξημένοι τόσο σε μονοστιβαδικές όσο και σε αλγινικές καλλιέργειες μετά από διέγερση με IL-1β και Pam2CSK4. Παράλληλα, παρατηρήθηκαν διακριτές διαφορές στα προφίλ έκκρισης πρωτεϊνών μεταξύ των διαφορετικών ερεθισμάτων και των συνθηκών καλλιέργειας. Επιπλέον, η ενδοκυτταρική φωσφοπρωτεωμική ανάλυση σε καλλιέργειες μονοστοιβάδας αποκάλυψε ότι η διέγερση με Pam2CSK4 και IL-1β προκάλεσε παρόμοια πρότυπα φωσφορυλίωσης των c-JUN, NF-kB και IKBA, πρωτεϊνών-κλειδιά στη ρύθμιση της φλεγμονώδους απόκρισης. Η ενεργοποίηση αυτών των σηματοδοτικών μονοπατιών συνοδεύτηκε από αυξημένη έκκριση φλεγμονωδών παραγόντων και πρωτεϊνών αποικοδόμησης της εξωκυττάριας μήτρας, ενισχύοντας έτσι τη σύνδεση μεταξύ των φλεγμονωδών διεργασιών και του εκφυλισμού του μεσοσπονδύλιου δίσκου. Αντίθετα, η αγωγή με H2O2 δεν επηρέασε σημαντικά τις ενδοκυτταρικές οδούς σηματοδότησης, γεγονός που συμφωνεί με την περιορισμένη επίδρασή της στη γονιδιακή και πρωτεϊνική έκφραση παραγόντων που είναι μέρος του εκφυλισμού. Συνολικά, η μελέτη αυτή συμβάλλει στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τον εκφυλισμό του μεσοσπονδύλιου δίσκου, υπογραμμίζοντας τον ρόλο συγκεκριμένων φλεγμονωδών μεσολαβητών και οδών σηματοδότησης. Η σταθερή ανοδική ρύθμιση πρωτεϊνών όπως η IL-6, η IL-8, η MMP7, η ICAM1 και η GROA σε διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας αναδεικνύει τη δυναμική τους ως πιθανούς θεραπευτικούς στόχους. Ο εντοπισμός φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών που εμπλέκονται στη έκκριση φλεγμονωδών μορίων παρέχει επιπλέον κατευθύνσεις για την ανάπτυξη στοχευμένων παρεμβάσεων με σκοπό τον μετριασμό του εκφυλισμού του δίσκου και των σχετιζόμενων συμπτωμάτων.