Identification and functional verification of new molecular targets of blood – cerebrospinal fluid and exosomes from patients with neurodegenerative diseases

Abstract

Neuronal degeneration and dysfunction are hallmark characteristics of neurodegenerative diseases (NDs). Currently, a significant challenge for researchers and clinicians is the development of reliable diagnostic tools that enable early diagnosis of NDs preferably in the presymptomatic stage. Despite decades of research and the approval of a small number of drugs by the Food and Drug Administration (FDA), halting the cognitive decline associated with neurodegeneration, continues to be a formidable challenge. Currently, the diagnosis of the majority of NDs relies on clinical examination and imaging techniques. Although these disorders arise from distinct pathophysiological mechanisms, they share overlapping fluid- and blood-based biomarkers, contributing to their diagnosis and characterization. Towards this direction, the first scope of the current dissertation thesis is the quantitative determination of selected protein biomarkers in cerebrospinal fluid (CSF) and blood (plasma/serum) to support the differential diagnosis of various NDs. Initially, the study started with the measurement of single plex trials of urokinase plasminogen activator surface receptor (uPAR) in a limited cohort of well characterized sporadic Creutzfeldt-Jakob disease (sCJD) patients, TAU protein, α-synuclein (α-syn) and YKL-40 (Chitinase 3-like 1) in a broad cohort of patients with synucleinopathies (Parkinson's disease (PD), Dementia with Lewy Bodies (DLB) and Multiple system atrophy (MSA)). The resulting biomarker concentrations lacked in sensitivity and specificity, not showing distinct cut-off values, highlighting the need for increased accuracy immunoassay-based platforms, providing a broader detection range for a more effective disease diagnosis and discrimination. Thus, a multiplex SIMOA panel of four biomarkers (glial fibrillary acidic protein (GFAP), neurofilament light chain (NfL), TAU, and ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1 (UCH-L1)), in two different clinical cohorts, was facilitated. Receiver operating characteristic (ROC) curve and area under the curve (AUC) analysis assessed the diagnostic accuracy of the tested biomarkers in CSF and blood of the patient cohorts. Regarding Alzheimer’s disease (AD) and Frontotemporal dementia (FTD) patients, the biomarker with the best diagnostic performance was CSF UCH-L1. The optimal cut-off values were identified at >1260 pg/mL for AD and >1052 pg/mL for FTD, supporting the utility of UCH-L1 as a promising biomarker for the differential diagnosis of these NDs. CSF NfL showed a good diagnostic accuracy distinguishing AD and FTD patients from Controls, with cut-off values at >688.8 pg/mL and >463.9 pg/mL, respectively. CSF TAU was the biomarker with the second-best performance after CSF UCH-L1 in discriminating AD patients from Controls, with calculated cut-off value >137.0 pg/mL, while showed a good diagnostic accuracy in the differentiation of AD from FTD patients. Also, good performance showed regarding FTD and Controls, with a cut-off value >111.3 pg/mL. Finally, CSF GFAP marked a fair diagnostic accuracy in the discrimination of AD patients from Control group, with cut-off value >5942 pg/mL. In the same pattern plasma and CSF GFAP indicated fair diagnostic performance in the differentiation of AD from FTD patients.In Multiple sclerosis (MS) and Clinically isolated syndrome (CIS), serum and CSF NfL illustrated a fair diagnostic accuracy in the discrimination of MS from CIS and Controls, with cut-off values >5.909 pg/mL and >453.4 pg/mL, respectively. Serum TAU was the biomarker with the best performance in distinguishing CIS from Controls, forming a cut-off value >0.5950 pg/mL, while in CSF was <75.26 pg/mL. Similar to these thresholds, it was also serum TAU diagnostic performance for MS patients, with cut-off values at >0.5823 pg/mL (in serum) and <76.47 pg/mL (in CSF). Lastly, serum GFAP showed a fair discriminating accuracy between MS and Controls with a cut-off value >48.08 pg/mL. To conclude, our results gave a new perspective and insights regarding UCH-L1 and GFAP in AD - FTD cohort and NfL and TAU in MS group, showing their potential implication in neuronal damage, protein degradation and disease progression. The second goal of the study is the investigation of the role of neuronal exosomes in the pathogenesis and spread of NDs (with emphasis on Prion disease). For this purpose, a pathogenic RML (Rocky Mountain Laboratories) mouse model was facilitated, giving us access to brain-derived exosome-enriched extracellular vesicles (ExE-EVs). Our study, showed that neuronal exosomes from healthy and Prion pathogenic mice, at early and late stages of the disease, share the same double-membrane, cup-shaped morphology, 50-200 nm ranging size and quantity (particles/mL). Proteomic analysis revealed 4337 proteins of which 1272 proteins found differentially regulated between Prion and Control groups. These alterations were mostly associated with mitochondrial function and endoplasmic reticulum (ER) membrane regulations. Prion pathology was one of the top pathways overrepresented in our database, consisting of 14 proteins showing differences in their abundance levels between Control and disease stage. More specifically, the main protein of our interest, Prion protein (PrP), showed 16-fold increase in the late stage of the Prion disease in comparison with the healthy mice. Together, this thesis offers a comprehensive overview of proteomic biomarkers of CSF, blood and exosomal material, in a variety of NDs. This thesis’ findings could contribute significantly to the field of biomarkers’ discovery, enhancing our understanding of their pathophysiology and their cut-off levels in scope of early and accurate diagnosis and therapeutic interventions.

Η νευρωνική εκφύλιση και δυσλειτουργία αποτελούν χαρακτηριστικά γνωρίσματα των νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Σήμερα, μια σημαντική πρόκληση για τους ερευνητές και τους κλινικούς ιατρούς είναι η ανάπτυξη αξιόπιστων διαγνωστικών εργαλείων που θα επιτρέπουν την έγκαιρη διάγνωση των νευροεκφυλιστικών ασθενειών, κατά προτίμηση στο προ συμπτωματικό στάδιο. Παρά τις δεκαετείς έρευνες και την έγκριση ορισμένων φαρμάκων από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων, η αναστολή της γνωστικής επιδείνωσης που σχετίζεται με τη νευροεκφύλιση παραμένει εξαιρετικά δύσκολη. Σήμερα, η διάγνωση της πλειονότητας των νευροεκφυλιστικών ασθενειών βασίζεται στην κλινική εξέταση και στις απεικονιστικές τεχνικές. Αν και οι διαταραχές αυτές προκύπτουν από διακριτούς παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς, μοιράζονται κοινούς βιοδείκτες από βιολογικά υγρά και αίμα, οι οποίοι συμβάλλουν στη διάγνωση και χαρακτηρισμό τους. Για αυτό το λόγο ο πρώτος στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι ο ποσοτικός προσδιορισμός επιλεγμένων πρωτεϊνικών βιοδεικτών στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) και στο αίμα (πλάσμα/ορός), με σκοπό την υποστήριξη της διαφορικής διάγνωσης διαφόρων νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Αρχικά, η μελέτη ξεκίνησε με την εφαρμογή μονοπλεκτικών δοκιμών του υποδοχέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (uPAR) σε περιορισμένη κοόρτη ασθενών με σποραδική νόσο Creutzfeldt-Jakob (sCJD), καθώς και των TAU, α-synuclein (α-syn) και YKL-40 (Chitinase 3-like 1) σε ευρύτερη κοόρτη ασθενών με συνουκλεϊνοπάθειες (νόσος Parkinson (PD), άνοια με σωμάτια Lewy (DLB) και ατροφία πολλαπλών συστημάτων (MSA)). Οι προκύπτουσες συγκεντρώσεις των βιοδεικτών αυτών παρουσίασαν έλλειψη ευαισθησίας και ειδικότητας, χωρίς διακριτά όρια διαχωρισμού (cutoff values), υπογραμμίζοντας την ανάγκη για μια πιο ακριβή πλατφόρμα ανοσοδοκιμασιών, με μεγαλυτερο εύρος ανίχνευσης, ικανή να επιτρέπει αποτελεσματική διάγνωση και διαφορική διάκριση μεταξύ των νοσημάτων.Για τον σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκε η πολυπλεκτική πλατφόρμα SIMOA τεσσάρων βιοδεικτών (γλοιακή ινώδης όξινη πρωτεΐνη (GFAP), ελαφριά αλυσίδα των νευρονημάτων (NfL), TAU και υδρολάση L1 του καρβοξυ-τελικού άκρου της ουβικιτίνης (UCH-L1)), σε δύο διαφορετικές κλινικές κοόρτες. Η καμπύλη λειτουργικών χαρακτηριστικών του δέκτη (ROC curve analysis) και η επιφάνεια κάτω από την καμπύλη (AUC) αξιολόγησαν τη διαγνωστική ακρίβεια των υπό μελέτη βιοδεικτών στο ΕΝΥ και στο αίμα των ασθενών. Όσον αφορά ασθενείς με νόσο Alzheimer (AD) και μετωποκροταφική άνοια (FTD), ο βιοδείκτης με την καλύτερη διαγνωστική απόδοση ήταν ο UCH-L1 στο ΕΝΥ. Οι βέλτιστες τιμές διαχωρισμού εντοπίστηκαν στα >1260 pg/mL για AD και >1052 pg/mL για FTD, επιβεβαιώνοντας τη χρησιμότητα του UCH-L1 ως υποσχόμενου βιοδείκτη για τη διαφοροδιάγνωση αυτών των νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Η NfL στο ΕΝΥ έδειξε καλή διαγνωστική ακρίβεια για τη διάκριση ασθενών με AD και FTD από υγιείς μάρτυρες, με τιμή διαχωρισμού >688,8 pg/mL και >463,9 pg/mL, αντίστοιχα. Η TAU στο ΕΝΥ εμφάνισε τη δεύτερη καλύτερη απόδοση μετά το UCH-L1 για τη διάκριση των AD από μάρτυρες, με τιμή διαχωρισμού >137,0 pg/mL, ενώ έδειξε καλή ακρίβεια και στη διάκριση των AD από τους FTD. Επίσης, καλή διαγνωστική ικανότητα παρατηρήθηκε στη διάκριση FTD από μάρτυρες με τιμή διαχωρισμού >111,3 pg/mL. Τέλος, η GFAP στο ΕΝΥ παρουσίασε μετρίου βαθμού ακρίβεια στη διάκριση AD από ομάδα μαρτύρων με τιμή διαχωρισμού >5942 pg/mL. Αντίστοιχα, η GFAP στο πλάσμα και στο ΕΝΥ έδειξε μέτρια απόδοση στη διάκριση AD από FTD.Στη Σκλήρυνση κατά πλάκας (MS) και στο Kλινικά μεμονωμένο σύνδρομο (CIS), η NfL στον ορό και στο ΕΝΥ έδειξε μέτρια διαγνωστική ακρίβεια στη διάκριση των MS από CIS και μάρτυρες, με τιμές διαχωρισμού >5,909 pg/mL και >453,4 pg/mL, αντίστοιχα. Η TAU στον ορό ήταν ο βιοδείκτης με την καλύτερη απόδοση στη διάκριση CIS από μάρτυρες, με τιμή διαχωρισμού >0,5950 pg/mL, ενώ στο ΕΝΥ <75,26 pg/mL. Παρόμοιες τιμές διαχωρισμού βρέθηκαν και για ασθενείς με MS (ορός >0,5823 pg/mL και ΕΝΥ <76,47 pg/mL). Τέλος, η GFAP στον ορό έδειξε μέτρια διαγνωστική ακρίβεια για τη διάκριση MS από μάρτυρες με τιμή διαχωρισμού >48,08 pg/mL. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματά μας προσφέρουν νέα προοπτική και πληροφορίες για τους βιοδείκτες UCH-L1 και GFAP στην κοόρτη AD-FTD, καθώς και για τους NfL και TAU στην ομάδα MS, αναδεικνύοντας τον πιθανό ρόλο τους στη νευρωνική βλάβη, την αποδόμηση πρωτεϊνών και την εξέλιξη της νόσου. Δεύτερος στόχος της μελέτης, είναι η διερεύνηση του ρόλου των νευρωνικών εξωσωμάτων στην παθογένεση και εξάπλωση των νευροεκφυλιστικών ασθενειών (με έμφαση στη νόσο Prion). Για τον σκοπό αυτό αξιοποιήθηκε παθολογικό μοντέλο μυός RML (Εργαστήριο Rocky Mountain), το οποίο μας παρείχε πρόσβαση σε εξωκυτταρικά κυστίδια εμπλουτισμένα με εξωσώματα (ExE-EVs) εγκεφαλικής προέλευσης. Η μελέτη μας έδειξε ότι τα νευρωνικά εξωσώματα από υγιή και παθολογικά (Prion) ποντίκια, τόσο σε πρώιμο όσο και σε όψιμο στάδιο της νόσου, μοιράζονται κοινά χαρακτηριστικά, όπως διπλή μεμβράνη, κυπελλοειδές σχήμα, μέγεθος 50–200 nm και συγκέντρωση (σωματίδια/mL). H πρωτεομική ανάλυση αποκάλυψε 4337 πρωτεΐνες, εκ των οποίων οι 1272 βρέθηκαν διαφοροποιημένες μεταξύ Prion και ομάδας ελέγχου. Οι μεταβολές αυτές σχετίζονταν κυρίως με μιτοχονδριακή λειτουργία και ρυθμίσεις της μεμβράνης του ενδοπλασματικού δικτύου. Η Prion παθολογία αναδείχθηκε ως ένα από τα βασικά παθολογικά μονοπάτια στο σύνολο των υπό μελέτη δεδομένων, με 14 πρωτεΐνες να εμφανίζουν διαφοροποιήσεις στην έκφρασή τους μεταξύ υγιών και παθολογικών δειγμάτων. Ειδικότερα, η πρωτεΐνη-στόχος μας, PrP, εμφάνισε 16πλάσια αύξηση στο όψιμο στάδιο της νόσου Prion σε σύγκριση με τα υγιή ποντίκια. Συνολικά, η παρούσα διατριβή προσφέρει μία ολοκληρωμένη επισκόπηση των πρωτεϊνικών βιοδεικτών του ΕΝΥ, του αίματος και του εξωσωμικού υλικού σε διάφορες νευροεκφυλιστικές ασθένειες. Τα ευρήματα της μελέτης δύνανται να συμβάλουν ουσιαστικά στον τομέα της ανακάλυψης βιοδεικτών, ενισχύοντας την κατανόηση της παθοφυσιολογίας τους και των τιμών διαχωρισμού τους, με απώτερο σκοπό την έγκαιρη και αξιόπιστη διάγνωση, καθώς και τις θεραπευτικές παρεμβάσεις.