Μελέτη και κλινική αξιολόγηση των miRNAs ως βιοδεικτών στην οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία της παιδικής ηλικίας

Abstract

IntroductionAcute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common neoplasm in the pediatric population. Despite notably high cure rates, relapse occurs in approximately 10–20% of children and adolescents with ALL and is associated with a significantly worse prognosis. Contemporary risk stratification protocols primarily rely on clinical and laboratory features and measurable residual disease (MRD). Nonetheless, there remains a critical need to identify additional biomarkers that better capture disease heterogeneity and enhance the prediction of adverse outcomes – particularly relapse. MicroRNAs (miRNAs or miRs), small non-coding RNAs that primarily regulate gene expression post-transcriptionally, are implicated in leukemogenesis, lymphoid differentiation, and chemoresistance. The clinical application of these molecules as biomarkers requires rigorous standardization of pre-analytical and analytical procedures, appropriate normalization techniques, and validation through independent studies. AimThe MICRO-CALLS study (MicroRNA levels in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia and Survival) aimed to investigate levels of selected miRNAs in relation to prognosis in children and adolescents with ALL and constitutes the subject of this dissertation. It comprises three phases: a preliminary phase, a pre-analytical phase, and the main experimental phase (quantification of selected miRNAs, evaluation of polymorphisms in miRNA biogenesis genes, and confirmation of findings using small RNA-seq). The preliminary phase aimed to identify microRNA signatures by molecular subtype in pediatric and adolescent ALL, based on immunophenotype and in cases with high relapse risk, using extensive RNA sequencing databases. Subsequently, the predictive performance of these signatures was evaluated to select candidate miRNAs for RT-qPCR validation within the study cohort. The pre-analytical phase aimed to evaluate factors that may influence RT-qPCR–measured miRNA levels, including specimen source (bone marrow versus peripheral blood; serum versus plasma), the interval from blood collection to miRNA extraction, the blast percentage in the initial sample, and potential differences between blood collected in EDTA tubes and coagulation tubes. The main experimental phase focused on identifying and clinically assessing miRNAs as prognostic biomarkers in pediatric and adolescent ALL, with a particular focus on relapse prediction and correlations with survival endpoints. Additionally, known polymorphisms in genes involved in miRNA biogenesis were genotyped to assess their relationships with measured miRNA levels and patient outcomes. Finally, small RNA sequencing was conducted to validate and enhance the RT-qPCR results and to evaluate the reproducibility of miRNA signatures across different methodologies. Materials and MethodsThis dissertation reports the MICRO-CALLS study, conducted in three phases: (i) preliminary in silico analysis and modeling in 123 children from the St. Jude Total XVI cohort (EGAD00001007530; St. Jude Children’s Research Hospital) using the JADBio autoML platform, (ii) a pre-analytical phase to identify variables that significantly affect miRNA expression levels and may act as confounders, and (iii) the main clinical–experimental phase focused on miRNA quantification by RT-qPCR, with confirmation by small RNA-seq, and on the investigation of associations between miRNA expression and polymorphisms in miRNA biogenesis genes (DROSHA, DICER1, and AGO1). A total of 142 children and adolescents with ALL diagnosed between 2004 and 2025 were included in the study, with follow-up conducted at the Department of Pediatric Hematology-Oncology at the University Hospital of Heraklion through December 7, 2025. The immunophenotype was B-ALL in 125 patients (88%) and T-ALL in 17 patients (12%). Relapse occurred in 13 patients (9.2%). Overall survival in the cohort was 92.3%. Clinico-laboratory parameters were systematically recorded: age and white blood cell count (WBC) at diagnosis, extramedullary central nervous system (CNS) involvement, peripheral blood blasts/μL on day 8 of induction (D8), MRD on days 15 and 33 of induction (MRD D15 and D33), cytogenetic features (karyotype, FISH, whole-exome sequencing [WES]), treatment protocol, and survival endpoints (overall survival [OS], event-free survival [EFS], relapse-free survival [RFS]), as well as an additional 47 variables examined in relation to measured miRNA levels. To better characterize unfavorable risk genetics (URG), WES was performed in ten diagnostic samples not previously assigned to a molecular subtype (“B-other”). Quantification was performed in bone marrow mononuclear cells (BMMNCs) using TaqMan Advanced miRNA Assays for 10 miRNAs: miR-16-5p, miR-21-5p, miR-24-3p, miR-125b-5p, miR-128-3p, miR-155-5p, miR-181a-5p, miR-191-5p, miR-223-3p, and miR-708-5p. Extraction efficiency was monitored using the exogenous spike-in cel-miR-39-3p, and hemolysis was assessed by measuring hsa-miR-451a. Amplification acceptance criteria (Cq thresholds for targets and reference genes) and inter-plate correction were applied according to MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) guidelines. Candidate reference miRNAs for normalization were miR-16-5p, miR-24-3p, and miR-191-5p. The most stable miRNA was miR-191-5p, and the optimal normalization pair was miR-191-5p with miR-16-5p; the geometric mean of the two was used as the normalization factor. Relative expression was calculated using the Livak 2−ΔΔCq method.Statistical analyses included parametric and nonparametric tests as appropriate, correlations (Spearman and Pearson), ROC analyses to define thresholds (Youden index), logistic regression, multivariable Cox regression adjusted for established risk factors, and survival analyses. Automated machine-learning approaches (JADBio) were also used to evaluate predictive models. Results The in silico analysis identified a 14-miRNA signature that distinguished T-ALL from B-ALL with excellent accuracy (AUC 99.5%), and the combined targeting analysis highlighted apoptosis as a dominant pathway. The same analysis indicated that an 18-miRNA signature could identify patients at high risk of relapse, a 5-miRNA signature could separate patients with URG, and additional subtype-specific miRNA signatures were identified. In this preliminary phase, miR-223 expression was linked to high-risk stratification and chemoresistance, and the role of miR-181a also emerged. The pre-analytical phase showed that delayed sample processing resulted in significant differences in measured miRNA levels (extraction within 1 hour vs storage for 6 or 24 hours, p < 0.01). Storage in sodium citrate tubes was associated with higher miRNA levels than in EDTA tubes, although this did not reach statistical significance. Paired-sample analysis (bone marrow, peripheral blood, serum, plasma) showed higher expression in bone marrow, particularly in BMMNCs (p < 0.01). No difference in miRNA expression was observed between serum and plasma.RT-qPCR revealed distinct miRNA expression profiles and associations with response and outcomes. Poor prednisone response (AAB D8 ≥ 1,000/μL) was associated with upregulation of miR-21-5p and downregulation of miR-125b-5p and miR-128-3p at diagnosis. Notably, miR-125b-5p and miR-128-3p levels showed a strong inverse relationship with WBC at diagnosis, and weighting by WBC and blast percentage yielded borderline significance for all observed associations (p = 0.03–0.05). MRD was significantly associated with five miRNAs. MRD D15 ≥ 10% was associated with high miR-21-5p and miR-181a-5p and low miR-125b-5p, miR-128-3p, and miR-708-5p. Among these, downregulation of miR-128-3p showed the strongest association (p < 0.001), followed by high miR-181a-5p. Similarly, MRD D33 ≥ 10−4 was significantly associated with high miR-21-5p and low miR-125b-5p, miR-128-3p, and miR-708-5p. The strongest and independent association was observed for miR-128-3p downregulation at diagnosis with high end-of-induction MRD (AUC 86.3%, 95% CI: 68–100%, p < 0.001; sensitivity 85.7%, specificity 91.2%), followed by a non-independent association for miR-125b-5p expression. Survival endpoints were also associated with five miRNAs. OS was significantly lower in children with high miR-181a-5p and low miR-125b-5p or miR-708-5p at diagnosis. Among these, markedly lower survival was observed in patients with miR-125b-5p downregulation at diagnosis (86.8% vs 94.2%, p = 0.002). In addition, a fivefold cumulative risk of death was estimated in the group with high miR-181a-5p (p = 0.02). Regarding RFS, several differences were noted compared with OS. Low miR-223-3p at diagnosis showed the strongest association with low RFS (72.4% vs 97.4%, p = 0.002), followed by high miR-155-5p (11.5-fold relapse risk; RFS 80.5% vs 98.3%, p = 0.006) and low miR-125b-5p (84.2% vs 94.2%, p = 0.036). Moreover, miR-223-3p downregulation at diagnosis appeared able to distinguish cases that subsequently relapsed with high accuracy and independently of other high-risk features (AUC 75.1%, p < 0.001), ranking just behind WBC ≥ 50,000/μL in multivariable Cox regression—with even larger differences when focusing on B-ALL. Consistently, low EFS in the cohort was significantly associated primarily with low miR-223-3p at diagnosis and secondarily with low miR-125b-5p, corresponding to a 7-fold (p = 0.004) and 3.5-fold (p = 0.03) increased risk of relapse or death, respectively. Additional significant associations between diagnostic miRNA levels and clinico-laboratory variables are discussed, highlighting frequent interactions. The JADBio platform was used to assess the combined predictive performance of all recorded variables for relapse and survival. The most reliable variable for relapse prediction was low miR-223-3p expression (mean accuracy 70.1%, AUC 63.9%). Additionally, a signature comprising miR-125b-5p levels and URG was identified as most specific for EFS prediction, but with only moderate mean accuracy (66.5%), despite high specificity (95.2%). Longitudinal assessment of miR-223-3p in ten patients (paired samples at diagnosis, D33, end of treatment ± relapse) confirmed its “protective” effect against relapse. Similarly, small RNA-seq documented a significant association of high miR-181a-5p and miR-155-5p, and low miR-223-3p, with relapse. Genotyping of DROSHA polymorphisms in 115 patients and 137 healthy controls showed that homozygotes for the minor allele of DROSHA rs642321 were associated with disease susceptibility (TT vs CC+CT, OR 4.5, 95% CI: 1.2–21.2, padj = 0.034). Likewise, homozygotes for the minor allele of DROSHA rs3805500 were associated with increased ALL risk (GG vs AA+AG, OR 2.7, 95% CI: 1.3–6.1, padj = 0.012). Among ALL patients, the rs3805500 AG genotype was significantly associated with relapse (OR 5.8, 95% CI: 1.6–24.3, padj = 0.011) and death (OR 5.0, 95% CI: 1.1–26.3, padj = 0.038). Patients carrying the rs3805500 AG and GG genotypes had lower survival indices. Polymorphisms in miRNA biogenesis genes showed significant effects on only two miRNAs: (i) homozygotes for the minor T allele of DROSHA rs642321 had increased miR-24-3p levels and higher Drosha expression, and were associated with age >10 years at diagnosis, T-ALL, TCF3::PBX1, and absence of hyperdiploidy; (ii) homozygotes for the major T allele of DROSHA rs10035440 showed upregulation of miR-181a-5p, higher Drosha expression, and association with poorer survival indices (OS, RFS, EFS).ConclusionsThe MICRO-CALLS study demonstrated that selected miRNAs may provide clinically useful prognostic information in pediatric and adolescent ALL. A key finding is the downregulation of miR-223-3p at diagnosis, which serves as an accurate and independent marker of relapse and diminished EFS, particularly in B-cell ALL. Furthermore, elevated miR-181a-5p, miR-155-5p, and miR-21-5p, along with decreased miR-125b-5p, miR-128-3p, and miR-708-5p, were associated with prognosis across multiple parameters, including glucocorticoid response, MRD, and survival outcomes. Concurrently, polymorphisms within genes involved in the microRNA biogenesis pathway appear to correlate with clinico-laboratory features of the disease, influencing expression levels and potentially the functionality of the associated ribonucleases and Argonaute proteins. The translational application of these findings requires independent validation in larger, multicenter cohorts and further standardization of pre-analytical and analytical variables. Looking ahead, integrating miRNA biomarkers with MRD and cytogenetic data may enhance relapse risk stratification and facilitate individualized treatment approaches in pediatric and adolescent ALL.

ΕισαγωγήΗ οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ΟΛΛ) αποτελεί τη συχνότερη νεοπλασία στον παιδιατρικό πληθυσμό. Παρά τα ιδιαίτερα υψηλά ποσοστά ίασης, η υποτροπή της νόσου αναμένεται στο 10 - 20 % των παιδιών και εφήβων με ΟΛΛ και έχει συσχετισθεί με σημαντικά πτωχότερη πρόγνωση. Η διαστρωμάτωση του κινδύνου υποτροπής στα σύγχρονα πρωτόκολλα βασίζεται τόσο σε κλινικο-εργαστηριακά χαρακτηριστικά όσο και στη μετρήσιμη υπολειπόμενη νόσο (MRD). Ωστόσο, υπάρχει ακόμη ανάγκη για την αναγνώριση επιπλέον βιοδεικτών που να αποτυπώνουν την ετερογένεια της νόσου και να συμβάλλουν στην πρόβλεψη δυσμενούς έκβασης –και ιδιαίτερα της υποτροπής. Τα microRNAs (miRNAs ή miR) είναι μικρά μη-κωδικά RNAs που ρυθμίζουν (κυρίως) μετα-μεταγραφικά τη γονιδιακή έκφραση και εμπλέκονται στη λευχαιμογένεση, στη διαφοροποίηση της λεμφικής σειράς, αλλά και στην αντίσταση στους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Η κλινική αξιοποίησή τους ως βιοδεικτών προϋποθέτει αυστηρή τυποποίηση προαναλυτικών και αναλυτικών παραμέτρων, κατάλληλη κανονικοποίηση και ανεξάρτητη επικύρωση των αποτελεσμάτων. Σκοπός Η μελέτη MICRO-CALLS (MicroRNA levels in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia and Survival) είχε στόχο τη μελέτη των επιπέδων επιλεγμένων miRNAs σε συνάρτηση με την πρόγνωση παιδιών και εφήβων με ΟΛΛ και συνιστά το αντικείμενο της παρούσας διατριβής. Διακρίνεται σε τρεις φάσεις: την προκαταρκτική φάση, την προαναλυτική φάση και το κυρίως πειραματικό μέρος (μέτρηση έκφρασης επιλεγμένων miRNAs, μελέτη πολυμορφισμών σε γονίδια βιογένεσης των miRNAs, επιβεβαίωση αποτελεσμάτων με small RNA-seq). Σκοπός της προκαταρκτικής φάσης ήταν να μελετήσει τις miRNA υπογραφές ανά μοριακό υπότυπο της ΟΛΛ παιδιών και εφήβων από μεγάλες βάσεις δεδομένων RNA-seq, ανά ανοσοφαινότυπο, αλλά και στις περιπτώσεις με υψηλό κίνδυνο υποτροπής, και να αξιολογήσει στη συνέχεια την προβλεπτική τους ικανότητα, ώστε να επιλεγούν τα κατάλληλα miRNAs για επαλήθευση στην κοόρτη της μελέτης με RT-qPCR. Σκοπός της προαναλυτικής φάσης ήταν η πιλοτική μελέτη παραγόντων που μπορεί να επηρεάζουν τα μετρούμενα επίπεδα των miRNAs με RT-qPCR, όπως η προέλευση του δείγματος (μυελός των οστών ή περιφερικό αίμα, ορός και πλάσμα), ο χρόνος παραμονής του δείγματος αίματος στο φιαλίδιο μέχρι την εκχύλιση των miRNAs, το ποσοστό των βλαστών στο αρχικό δείγμα, αλλά και πιθανές διαφορές στη μέτρηση των miRNAs μεταξύ της συλλογής αίματος σε φιαλίδιο γενικής αίματος και πήξης. Σκοπός του κυρίως πειραματικού μέρους της διατριβής ήταν η αναγνώριση και κλινική αξιολόγηση miRNAs ως βιοδεικτών πρόγνωσης σε παιδιά και έφηβους με ΟΛΛ, με έμφαση στην πρόβλεψη της υποτροπής και στη συσχέτιση με δείκτες επιβίωσης. Επιπρόσθετα, διενεργήθηκε γονοτύπηση γνωστών πολυμορφισμών σε γονίδια της βιογένεσης των miRNAs, ώστε να διερευνηθεί η σχέση τους με τα μετρούμενα επίπεδα miRNAs και την έκβαση των ασθενών. Στο τελευταίο μέρος αυτής της φάσης της μελέτης διενεργήθηκε small RNA-seq με σκοπό την επιβεβαίωση και αύξηση της εγκυρότητας των αποτελεσμάτων των αντιδράσεων της RT-qPCR για την ασφαλή εξαγωγή χρήσιμων συμπερασμάτων και την εξέταση αναπαραγωγιμότητας των miRNA υπογραφών μεταξύ των δύο μεθόδων. Υλικό και Μέθοδοι Το σύνολο της παρούσας διατριβής συνιστά τη μελέτη MICRO-CALLS, η οποία αναπτύχθηκε σε τρεις φάσεις: (i) την προκαταρκτική in silico ανάλυση/μοντελοποίηση σε 123 παιδιά της St. Jude Total XVI κοόρτης EGAD00001007530 (St. Jude Children’s Research Hospital) με τη βοήθεια της autoML πλατφόρμας JADBio, (ii) την προ-αναλυτική φάση, για την αναγνώριση τυχόν μεταβλητών που επηρεάζουν σημαντικά τα επίπεδα της έκφρασης των miRNAs και μπορεί να αποτελούν συγχυτικούς παράγοντες και (iii) το κυρίως κλινικό-πειραματικό μέρος, με κεντρικό άξονα την ποσοτικοποίηση miRNAs με RT-qPCR και επιβεβαίωση με small RNA-seq, αλλά και τη διερεύνηση της σχέσης της miRNA έκφρασης με πολυμορφισμούς σε γονίδια της βιογένεσης των miRNAs (DROSHA, DICER1 και AGO1). Στη μελέτη εντάχθηκαν 142 παιδιά και έφηβοι με ΟΛΛ (με διάγνωση από το 2004 έως και το 2025), με παρακολούθηση στην Κλινική Αιματολογίας-Ογκολογίας Παίδων του ΠαΓΝΗ έως τις 07/12/2025. Ο ανοσοφαινότυπος ήταν Β-ΟΛΛ σε 125 παιδιά (88 %) και Τ-ΟΛΛ σε 17 (12 %). Υποτροπή καταγράφηκε σε 13/142 (9,2 %) περιπτώσεις. Η συνολική επιβίωση στην κοόρτη ήταν 92,3 %. Καταγράφηκαν συστηματικά κλινικο-εργαστηριακές παράμετροι: ηλικία και λευκά αιμοσφαίρια (WBC) στη διάγνωση, η εξωμυελική εντόπιση στο κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ), οι βλάστες /μL στο περιφερικό αίμα την 8η ημέρα της θεραπείας εφόδου (AAB D8), η μετρήσιμη υπολειπόμενη νόσος τις ημέρες 15 και 33 της θεραπείας εφόδου (MRD D15 και D33), τα ιδιαίτερα κυτταρογενετικά χαρακτηριστικά (καρυότυπος, FISH, αλληλούχιση ολόκληρου του εξώματος ή WES), το θεραπευτικό πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε, οι δείκτες επιβίωσης (συνολική επιβίωση ή OS, επιβίωση ελεύθερη συμβαμάτων ή EFS και επιβίωση ελεύθερη υποτροπής ή RFS), καθώς και επιπλέον 47 μεταβλητές για τη μελέτη τους σε σχέση με τα επίπεδα των μετρούμενων miRNAs. Για την καλύτερη μελέτη της σχέσης των δυσμενών κυτταρογενετικών χαρακτηριστικών (URG) διενεργήθηκε WES σε δέκα δείγματα διάγνωσης που δεν είχαν μέχρι πρότινος ενταχθεί σε κάποιο μοριακό υπότυπο της νόσου (“B-other”). Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε σε μονοπύρηνα κύτταρα μυελού των οστών (BMMNCs) με TaqMan Advanced miRNA Assays για 10 miRNAs: miR-16-5p, miR-21-5p, miR-24-3p, miR-125b-5p, miR-128-3p, miR-155-5p, miR-181a-5p, miR-191-5p, miR-223-3p και miR-708-5p. Για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας της εκχύλισης χρησιμοποιήθηκε ως εξωγενής μάρτυρας (spike-in) το cel-miR-39-3p, ενώ για την αξιολόγηση της αιμόλυσης μετρήθηκαν τα επίπεδα του hsa-miR-451a. Εφαρμόστηκαν κριτήρια αποδοχής ενισχύσεων (όρια Cq για στόχους και γονίδια αναφοράς) και δια-πλακιδιακή (inter-plate) διόρθωση, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments). Για την κανονικοποίηση διερευνήθηκαν ως υποψήφια miRNAs αναφοράς τα miR-16-5p, miR-24-3p και miR-191-5p. Το πιο σταθερό miR ήταν το miR-191-5p, ενώ το καταλληλότερο ζεύγος κανονικοποίησης ήταν το miR-191-5p μαζί με το miR-16-5p και ως παράγοντας κανονικοποίησης χρησιμοποιήθηκε ο γεωμετρικός μέσος τους. Η σχετική έκφραση υπολογίσθηκε με τη μέθοδο Livak 2−ΔΔCq. Στατιστικά, εφαρμόστηκαν παραμετρικές ή μη παραμετρικές δοκιμασίες ανάλογα με την κατανομή, συσχετίσεις (Spearman/Pearson), αναλύσεις ROC για καθορισμό ορίων (Youden), λογιστική παλινδρόμηση, πολυπαραγοντική Cox παλινδρόμηση για προσαρμογή σε καθιερωμένους παράγοντες κινδύνου, αλλά και αναλύσεις επιβίωσης. Συμπληρωματικά, εφαρμόστηκαν αυτοματοποιημένες προσεγγίσεις μηχανικής μάθησης (πλατφόρμα JADBio) για αξιολόγηση προβλεπτικών μοντέλων. Αποτελέσματα Η in silico μελέτη αποκάλυψε μια υπογραφή 14 miRNAs που διέκρινε τις Τ-ΟΛΛ από τις Β-ΟΛΛ περιπτώσεις με εξαιρετική ακρίβεια (AUC 99,5 %), ενώ η ανάλυση συνδυαστικής στόχευσης ανέδειξε τον κυρίαρχο ρόλο της απόπτωσης. Η ίδια μελέτη κατέληξε πως μια υπογραφή 18 miRNAs ήταν ικανή να διακρίνει τους ασθενείς υψηλού κινδύνου για υποτροπή, μια υπογραφή μόλις 5 miRNAs που μπορούσε να ξεχωρίσει τους ασθενείς με URG, αλλά και υπογραφές miRNAs ειδικές για κάθε μοριακό υπότυπο της νόσου. Στην προκαταρκτική αυτή φάση, τα επίπεδα έκφρασης του miR-223 συνδέθηκαν με τη διαστρωμάτωση υψηλού κινδύνου και τη χημειοανθεκτικότητα, ενώ ξεχώρισε και ο ρόλος του miR-181a. Η προαναλυτική φάση έδειξε πως η καθυστέρηση της επεξεργασίας των δειγμάτων είχε ως αποτέλεσμα σημαντικές διαφοροποιήσεις στα επίπεδα των μετρούμενων miRNAs (εκχύλιση εντός μίας ώρας έναντι παραμονής στη συντήρηση για 6 ή 24 ώρες, p < 0,01). Η φύλαξη του δείγματος σε σωληνάριο με κιτρικό νάτριο συνδέθηκε με σχετική αύξηση των μετρούμενων miRNAs συγκριτικά με τα σωληνάρια EDTA (αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ), αλλά η σχέση αυτή δεν ξεπέρασε το όριο της σημαντικότητας. Η μελέτη συζευγμένων δειγμάτων μυελού οστών, περιφερικού αίματος, ορού και πλάσματος ανέδειξε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης στο μυελό των οστών και δη στα BMMNCs (p < 0,01). Δε διαπιστώθηκε διαφορά στην miRNA έκφραση μεταξύ ορού και πλάσματος. Η RT-qPCR ανάλυση ανέδειξε διακριτά προφίλ έκφρασης miRNAs και συσχετίσεις με δείκτες ανταπόκρισης και έκβασης. Η κακή ανταπόκριση στην πρεδνιζόνη (AAB D8 ≥ 1.000 /μL) συσχετίστηκε με την αυξορρύθμιση του miR-21-5p και τη μειορρύθμιση των miR-125b-5p και miR-128-3p στη διάγνωση. Σημειώνεται η ταυτόχρονη ισχυρή αντίστροφη σχέση των επιπέδων miR-125b-5p και miR-128-3p με τον αριθμό των WBC κατά τη διάγνωση, ενώ η στάθμιση με τα επίπεδα των WBC και το ποσοστό των βλαστών οδήγησε σε οριακή σημαντικότητα όλων των παρατηρούμενων συσχετίσεων (p = 0,03 – 0,05).Η υπολειπόμενη νόσος συσχετίστηκε σημαντικά με τα επίπεδα πέντε miRNAs. Η MRD D15 ≥ 10% συσχετίστηκε με τα υψηλά επίπεδα miR-21-5p και miR-181a-5p, αλλά και τα χαμηλά επίπεδα miR-125b-5p, miR-128-3p και miR-708-5p. Μεταξύ αυτών, η μειορρύθμιση του miR-128-3p εμφάνισε την ισχυρότερη συσχέτιση (p < 0,001), ακολουθούμενη από τα υψηλά επίπεδα miR-181a-5p. Ομοίως, ως προς την MRD D33 ≥ 10-4, παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση με τα υψηλά επίπεδα miR-21-5p και τα χαμηλά επίπεδα miR-125b-5p, miR-128-3p και miR-708-5p. Η πλέον ισχυρή και ανεξάρτητη σχέση υπολογίστηκε για τη μειορρύθμιση του miR-128-3p στη διάγνωση και την υψηλή MRD στο τέλος της φάσης της επαγωγής της ύφεσης (AUC 86,3 % με 95 % CI: 68 – 100 %, και p < 0,001, ευαισθησία 85,7 %, ειδικότητα 91,2 %) –ακολουθούμενη από τη μη-ανεξάρτητη σχέση της έκφρασης του miR-125b-5p. Οι δείκτες επιβίωσης συσχετίστηκαν επίσης με τα επίπεδα πέντε miRNAs. Η OS ήταν σημαντικά χαμηλότερη στα παιδιά που βρέθηκαν με υψηλά επίπεδα miR-181a-5p και χαμηλά επίπεδα miR-125b-5p ή miR-708-5p κατά τη διάγνωση. Μεταξύ αυτών, ξεχώρισε η σημαντικά χαμηλότερη επιβίωση στους ασθενείς με μειορρύθμιση του miR-125b-5p στη διάγνωση (86,8 % έναντι 94,2 % και p = 0,002). Επιπρόσθετα, υπολογίστηκε πενταπλάσιος αθροιστικός κίνδυνος για θάνατο στην ομάδα με υψηλά επίπεδα miR-181a-5p (p = 0,02). Ως προς την RFS υπήρξαν αρκετές διαφοροποιήσεις σε σχέση με την OS και τα επίπεδα miRNAs στη διάγνωση. Τα χαμηλά επίπεδα miR-223-3p στη διάγνωση ξεχώρισαν και παρουσίασαν την ισχυρότερη συσχέτιση με τη χαμηλή RFS (72,4 % έναντι 97,4 % και p = 0,002), ενώ έπονται τα υψηλά επίπεδα miR-155-5p (11,5-πλάσιος κίνδυνος για υποτροπή, RFS 80,5 % έναντι 98,3 %, p = 0,006) και τα χαμηλά επίπεδα miR-125b-5p (84,2 % έναντι 94,2 %, p = 0,036). Μάλιστα, η μειορρύθμιση του miR-223-3p στη διάγνωση φαίνεται ικανή να διακρίνει τις περιπτώσεις που θα παρουσιάσουν υποτροπή με μεγάλη ακρίβεια και ανεξάρτητα από τα λοιπά χαρακτηριστικά αυξημένου κινδύνου (AUC 75,1 %, p < 0,001), μόλις πίσω από τα WBC ≥ 50.000 /μL στην πολυπαραγοντική Cox ανάλυση παλινδρόμησης –με ακόμα μεγαλύτερες διαφορές, εστιάζοντας στη Β-ΟΛΛ. Κατά αναλογία, η χαμηλή EFS στην κοόρτη συσχετίστηκε σημαντικά πρωτίστως με τα χαμηλά επίπεδα miR-223-3p στη διάγνωση και κατόπιν με τα χαμηλά επίπεδα miR-125b-5p, παρουσιάζοντας 7-πλάσιο (p = 0,004) και 3,5-πλάσιο κίνδυνο για υποτροπή ή θάνατο (p = 0,03), αντίστοιχα. Στα αποτελέσματα της διατριβής συζητούνται και άλλες σημαντικές συσχετίσεις των επιπέδων miRNAs στη διάγνωση με κλινικο-εργαστηριακές μεταβλητές και αναδεικνύεται η συχνή αλληλεπίδραση αυτών. Για τη συνδυαστική προβλεπτική ικανότητα όλων των κλινικο-εργαστηριακών μεταβλητών που καταγράφηκαν στη μελέτη ως προς την εμφάνιση υποτροπής και την επιβίωση χρησιμοποιήθηκε η πλατφόρμα JADBio. Η πλέον αξιόπιστη μεταβλητή για την πρόβλεψη της υποτροπής αναδείχθηκε η χαμηλή έκφραση του miR-223-3p (μέση ακρίβεια 70,1 % και AUC 63,9 %). Επιπρόσθετα, η υπογραφή αποτελούμενη από τα επίπεδα του miR-125b-5p και τα URG ως την πλέον ειδική για την πρόβλεψη της EFS, αλλά με μέση ακρίβεια μόλις 66,5 %, παρόλο που η ειδικότητα ήταν σε υψηλά επίπεδα (95,2 %). Η διαχρονική μελέτη των επιπέδων miR-223-3p σε δέκα ασθενείς (συζευγμένα δείγματα σε διάγνωση, D33, τέλος θεραπείας ± υποτροπή) επιβεβαίωσε την «προστατευτική» επίδρασή του έναντι της υποτροπής. Ομοίως, η small RNA-seq μελέτη τεκμηρίωσε τη σημαντική σχέση των υψηλών επιπέδων miR-181a-5p και miR-155-5p, αλλά και των χαμηλών επιπέδων miR-223-3p με την υποτροπή της νόσου. Η μελέτη των πολυμορφισμών στο γονίδιο της DROSHA σε 115 ασθενείς και 137 υγιείς μάρτυρες έδειξε ότι οι ομοζυγώτες για το έλασσον αλληλόμορφο στον DROSHA rs642321 συσχετίστηκαν με την προδιάθεση για τη νόσο (TT έναντι CC+CT, OR 4,5 με 95% CI: 1,2 – 21,2 και padj = 0,034). Ομοίως, οι ομοζυγώτες για το έλασσον αλληλόμορφο στον DROSHA rs3805500 συσχετίστηκαν με αυξημένο κίνδυνο για ΟΛΛ (GG έναντι AA+AG, OR 2,7 με 95% CI: 1,3 – 6,1 και padj = 0,012). Μεταξύ των ασθενών με ΟΛΛ, παρατηρήθηκαν σημαντικές συσχετίσεις του rs3805500 AG γονοτύπου τόσο με την εμφάνιση υποτροπής (OR 5,8 με 95% CI: 1,6 – 24,3 και padj = 0,011) όσο και με τους ασθενείς που απεβίωσαν (OR 5 με 95% CI: 1,1 – 26,3 και padj = 0,038). Στο ίδιο πλαίσιο, οι ασθενείς που έφεραν τους rs3805500 AG και GG γονότυπους εμφάνισαν χαμηλότερους δείκτες επιβίωσης. Οι πολυμορφισμοί στα γονίδια βιογένεσης των miRNAs εμφάνισαν σημαντικές επιδράσεις στα επίπεδα μόλις δύο miRNAs: (i) Οι ομοζυγώτες για το έλασσον Τ αλλήλιο στον DROSHA rs642321 βρέθηκαν με αυξημένα επίπεδα miR-24-3p και υψηλότερη έκφραση Drosha, ενώ συνδέθηκαν με διάγνωση > 10 ετών, Τ-ΟΛΛ, TCF3::PBX1 και καθόλου υπερδιπλοειδία. (ii) Οι ομοζυγώτες για το μείζον T αλλήλιο στον DROSHA rs10035440 εμφάνισαν αυξορρύθμιση του miR-181a-5p με επίσης υψηλότερη έκφραση Drosha και συσχέτιση με χαμηλότερους δείκτες επιβίωσης (OS-RFS-EFS). Συμπεράσματα Η μελέτη MICRO-CALLS έδειξε πως επιλεγμένα miRNAs δύνανται να φέρουν κλινικά αξιοποιήσιμη προγνωστική πληροφορία στην ΟΛΛ παιδιών και εφήβων. Κεντρικό εύρημα της μελέτης αποτελεί η μειορρύθμιση του miR-223-3p στη διάγνωση ως ακριβής και ανεξάρτητος δείκτης υποτροπής και δυσμενέστερης EFS, ιδίως στη Β-ΟΛΛ. Επιπλέον, τα υψηλά επίπεδα miR-181a-5p, miR-155-5p και miR-21-5p και τα χαμηλά επίπεδα miR-125b-5p, miR-128-3p και miR-708-5p συσχετίστηκαν με την πρόγνωση της νόσου σε διάφορα επίπεδα (ανταπόκριση στα γλυκοκορτικοειδή, MRD και δείκτες επιβίωσης). Συναφώς, οι πολυμορφισμοί στα γονίδια της οδού βιογένεσης των miRNAs φαίνεται να συνδέονται με κλινικο-εργαστηριακά χαρακτηριστικά της νόσου, επηρεάζοντας τα επίπεδα, αλλά και τη λειτουργικότητα, των εμπλεκομένων ριβονουκλεασών και πρωτεϊνών Αργοναυτών. Η μεταφραστική αξιοποίηση των ευρημάτων της παρούσας μελέτης προϋποθέτει την ανεξάρτητη επικύρωση σε μεγαλύτερες και πολυκεντρικές κοόρτες, καθώς και την περαιτέρω τυποποίηση των προαναλυτικών και αναλυτικών μεταβλητών. Μελλοντικά, η συνδυαστική ενσωμάτωση των miRNA βιοδεικτών στην MRD και στα κυτταρογενετικά δεδομένα δύναται να ενισχύσει την ακρίβεια διαστρωμάτωσης κινδύνου για υποτροπή και να υποστηρίξει την εξατομίκευση της θεραπευτικής στρατηγικής στην ΟΛΛ παιδιών και εφήβων.