Μοριακή ταυτοποίηση στελεχών Echinococcus granulosus σε μηρυκαστικά ζώα στην Ελλάδα

Abstract

In the present study, identification of species and genotypes and determination of the haplotypes of the Echinococcus granulosus sensu lato cluster was performed using as starting material hydatid cysts, isolated from carcasses of ruminants. A total of 740 carcasses (438 sheep, 227 goats and 75 cattle) were examined during scheduled visits to approved slaughterhouses within Greece. For comparison purposes, examination of 416 cattle carcasses was conducted in a local slaughterhouse in Elazig, Eastern Anatolia, Turkey. The hydatid cysts which were isolated from the infected carcasses in both countries were assessed for the presence of protoscoleces within them, with the use of a light microscope. The molecular analysis was conducted in a single hydatid cyst from each carcass which was found to be infected. Total genomic DNA was isolated from the germinal layer of the hydatid cyst and polymerase chain reaction as performed targeting fragments of three mitochondrial genetic loci (12S rRNA, CO1, NADH1). Sequencing was conducted for CO1 and NADH1 genetic loci and the results were analysed, both independently (CO1, NADH1) and combined (CO1+NADH1), with the use of freely available bioinformatics tools. Single nucleotide polymorphisms were detected, and the results were compared with relevant reports from Greece, the Balkans and Mediterranean countries. Molecular analysis demonstrated a clear predominance of Echinococcus granulosus sensu stricto in Greece and the sympatric occurrence of Echinococcus granulosus sensu stricto and Echinococcus canadensis in the Peloponnese. The active involvement of sheep in the life cycle of Echinococcus canadensis (genotype G7) is confirmed in this study. Although this parasite species has been reported in goat carcasses in the Peloponnese, its identification in fertile hydatid cysts of sheep origin in that region of the country is being presented for the first time. Echinococcus granulosus sensu stricto was the sole Echinococcus granulosus sensu lato species identified in carcasses in Turkey. Combined analysis demonstrated the occurrence of 22 Echinococcus granulosus sensu stricto haplotypes (genotypes G1, G3) and one Echinococcus canadensis (genotype G7) haplotype in carcasses in Greece, whereas a total of 16 Echinococcus granulosus sensu stricto haplotypes were identified in carcasses in Turkey. The two countries shared haplotypes, however, unique haplotypes for each country were also found. The results demonstrated the presence in Greece of the Echinococcus granulosus sensu lato haplotypes identified in animals and humans in the Balkans and the Mediterranean countries. Furthermore, the identification of Echinococcus canadensis genotype G7 in fertile hydatid cysts of sheep origin in the Peloponnese should be taken into account in the regular antiparasitic treatment of dogs due to the shorter maturation period of the adult tapeworm and the speedier onset of egg production in the final host, in comparison to Echinococcus granulosus sensu stricto. Secondary findings of this study were the higher rate of parasitic infection in sheep carcasses in comparison to goat carcasses and cattle carcasses, and the occurrence of hydatid cysts exclusively in the carcasses of the adult animals. Looking to the future, the results presented here could be utilised for the implementation of a control programme for cystic echinococcosis both at local and national level in Greece.

Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε μοριακή ταυτοποίηση των ειδών και των γονότυπων καθώς και προσδιορισμός των απλότυπων του συμπλέγματος Echinococcus granulosus sensu lato σε υδατίδες κύστεις που λήφθηκαν από σφάγια μηρυκαστικών ζώων σε εγκεκριμένα σφαγεία της Ελλάδας. Συνολικά, ελέγχθηκαν 740 σφάγια νεαρών και ενήλικων μηρυκαστικών (438 πρόβατα, 227 αίγες και 75 βοοειδή). Με στόχο τη σύγκριση των αποτελεσμάτων, ελέγχθηκαν επίσης 416 σφάγια ενήλικων βοοειδών σε σφαγείο της επαρχίας Elazig της Ανατολικής Ανατολίας στην Τουρκία. Οι υδατίδες κύστεις που απομονώθηκαν από τα μολυσμένα σφάγια στις δυο χώρες ελέγχθηκαν για την παρουσία πρωτοσκωλήκων σε αυτές με τη βοήθεια του οπτικού μικροσκοπίου. Για τη μοριακή ανάλυση επιλέχθηκε μια υδατίδα κύστη από κάθε μολυσμένο σφάγιο. Η πειραματική προσέγγιση περιέλαβε την απομόνωση ολικού DNA από τη βλαστική στιβάδα της υδατίδας κύστης και την ενίσχυση μέσω αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης τμημάτων τριών μιτοχονδριακών γενετικών τόπων (12S rRNA, CO1, NADH1). Προσδιορισμός αλληλουχίας (sequencing) πραγματοποιήθηκε για τους γενετικούς τόπους CO1 και NADH1. Ανεξάρτητη ανάλυση (CO1, NADH1) καθώς και συνδυασμένη ανάλυση (CO1+NADH1) των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ελεύθερα διαθέσιμων εργαλείων Βιοπληροφορικής. Οι πολυμορφισμοί μονού νουκλεοτιδίου ανιχνεύτηκαν και τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με σχετικές αναφορές από την Ελλάδα, τα Βαλκάνια και χώρες της Μεσογείου. Η μοριακή ταυτοποίηση κατέδειξε την κυρίαρχη παρουσία του είδους Echinococcus granulosus sensu stricto (γονότυποι G1 και G3) στην Ελλάδα καθώς και τη συμπατρική παρουσία των ειδών Echinococcus granulosus sensu stricto και Echinococcus canadensis (γονότυπος G7) στην Πελοπόννησο. Το είδος Echinococcus canadensis (γονότυπος G7) που έχει ήδη αναφερθεί σε αίγες στην Πελοπόννησο, στην παρούσα μελέτη ταυτοποιήθηκε για πρώτη φορά σε γόνιμες υδατίδες κύστεις δυο σφάγιων προβάτων από την Αρκαδία και την Ηλεία. Στις υδατίδες κύστεις των βοοειδών στην Τουρκία διαπιστώθηκε η αποκλειστική παρουσία του είδους Echinococcus granulosus sensu stricto (γονότυποι G1 και G3). Η συνδυασμένη ανάλυση κατέδειξε την παρουσία 22 απλότυπων του είδους Echinococcus granulosus sensu stricto και ενός απλότυπου του είδους Echinococcus canadensis (γονότυπος G7) στα σφάγια Ελλάδας ενώ στα σφάγια Τουρκίας ταυτοποιήθηκαν 16 απλότυποι του είδους Echinococcus granulosus sensu stricto. Κοινοί παρασιτικοί απλότυποι ταυτοποιήθηκαν στα σφάγια των δυο χωρών, ωστόσο διαπιστώθηκε και η παρουσία μοναδικών απλότυπων για κάθε χώρα. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν την παρουσία στην Ελλάδα απλότυπων του συμπλέγματος Echinococcus granulosus sensu lato που έχουν ταυτοποιηθεί στα ζώα και τον άνθρωπο στα Βαλκάνια και τις χώρες της Μεσογείου. Επιπλέον, η παρουσία γόνιμων υδατίδων κύστεων του είδους Echinococcus canadensis (γονότυπος G7) στα σφάγια προβάτων τονίζει την αναγκαιότητα αλλαγής των μεσοδιαστημάτων της προληπτικής αποπαρασίτωσης του σκύλου, εφόσον το είδος αυτό εχινοκόκκου έχει αποδειχθεί ότι παρουσιάζει βραχύτερο χρόνο ωρίμανσης και έναρξης ωοτοκίας στο λεπτό έντερο του σκύλου σε σχέση με το Echinococcus granulosus sensu stricto. Παράπλευρα ευρήματα της μελέτης ήταν η ανεύρεση υδατίδων κύστεων αποκλειστικά στα σφάγια των ενήλικων μηρυκαστικών και το υψηλότερο ποσοστό μόλυνσης των σφάγιων προβάτων σε σχέση με τα σφάγια των αιγών και των βοοειδών. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης θα μπορούσαν να ληφθούν υπόψη στην εφαρμογή ενός μελλοντικού προγράμματος ελέγχου της κυστικής εχινοκοκκίασης στη χώρα μας, σε επίπεδο τοπικό ή εθνικό.