Investigating the role of extracellular matrix proteins in peripheral skeletal muscle adaptation in COPD patients

Abstract

Background: Cachexia and muscle wasting are prevalent extrapulmonary comorbidities observed in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) associated with decreased quality of life and increased mortality rates. While exercise training is the primary therapeutic strategy that attenuates the detrimental effects of muscle wasting in COPD, cachectic patients do not present the same degree of muscle remodelling capacity compared to non-cachectic COPD patients. Extracellular matrix (ECM) represents a dynamic and complex environment that is highly responsive to external stimuli. ECM plays a pivotal role in maintaining the structural integrity of skeletal muscle and orchestrating essential physiological processes during growth, regeneration, and remodelling. Imbalance in ECM composition, which can occur during aging or in the presence of pathological muscular conditions have profound effects on muscle homeostasis, function, and overall structure. Although various biological mechanisms contributing to COPD-related muscle wasting have been identified, the involvement of ECM in this condition remains largely unknown. Hypothesis: It was hypothesised that COPD patients would exhibit distinct alterations in the composition of skeletal muscle ECM compared to healthy individuals. It was also hypothesised that the completion of an exercise training intervention would induce differential ECM expression adaptations in cachectic COPD patients compared to non-cachectic and healthy controls. Given that cigarette smoking (CS) is the most significant contributing factor to the development of COPD, it was expected to alter the expression of ECM components in skeletal muscle. Objectives: The current study aimed to explore, for the first time, the composition of ECM in the skeletal muscle of COPD patients. It aimed also to identify whether the effect of exercise training induces altered adaptive responses in ECM composition among cachectic, non-cachectic COPD patients and healthy controls and to examine the molecular pathways involved. In addition, the study sought to screen potential molecular pathways involved in these ECM adaptations to understand the mechanisms involved in the restricted adaptive response seen in cachectic muscle after exercise. Furthermore, another aim of this study was to explore the effect of exposure to CS and acute hypoxia on the expression of skeletal muscle ECM components. Moreover, the effect of a tobacco compound on myogenic differentiation was investigated to further understand the influence of CS on muscle ECM dynamics. Methods: The study investigated the gene and protein expression of selected ECM molecules in the vastus lateralis biopsies of 29 COPD patients [19 non-cachectic patients (FFMI >17 kg•m-2), and 10 cachectic patients (FFMI <17 kg•m-2)], as well as 14 healthy controls, before and after participation in a training intervention. Additionally, the impact of exposure to CS and acute hypoxia on ECM gene expression was examined in the gastrocnemius muscle of guinea pigs. Furthermore, in vitro differentiation of C2C12 myotubes was utilized to assess the effects of cotinine treatment on ECM, myogenic, and differentiation markers. The assessment of gene expression was performed using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR), while protein expression was determined through enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) techniques. Results: At baseline, COPD patients demonstrated distinct changes in the transcription and translation of key ECM molecules linked to muscle structure, regeneration, and repair. Baseline differences between non-cachectic and cachectic COPD patients were observed only at the transcriptional level, with cachectic patients displaying decreased transcriptional activity of ECM molecules. Upon exercise training, contrasting adaptations were observed between cachectic COPD patients and the cohorts with preserved muscle mass at both the expression of ECM and myogenic markers. Conversely, non-cachectic COPD patients and healthy individuals demonstrated similar responses to exercise training. Phospho-kinase analysis revealed that activation of p38 MAPK signalling pathway could be a potential pathway involved in the limited remodelling capacity seen in cachectic COPD patients after exercise training. In addition, exposure to CS directly affected the skeletal muscle ECM composition, while acute hypoxia also induced changes but at a smaller magnitude. In vitro findings showed that presence of cotinine, a tobacco by-product, hindered the myogenic and differentiative capacity of C2C12 myoblasts, as well as ECM transcription. Conclusions: This study provides novel insights into the differential basal ECM composition of skeletal muscle between COPD patients and healthy individuals. In addition, our findings highlight that exercise training induces altered response in the expression of ECM molecules in cachectic COPD patients compared to non-cachectic and healthy individuals, concomitant with the enhancement of a glycolytic phenotype. These results demonstrate the potential involvement of an imbalanced ECM composition in the observed limited remodelling capacity seen in cachectic COPD patients after exercise training. Importantly, targeting ECM molecules may hold therapeutic significance for combatting COPD muscle wasting.

Εισαγωγή: Η καχεξία και η μυϊκή απώλεια αποτελούν συχνές εξωπνευμονικές νοσηρότητες που παρατηρούνται σε ασθενείς με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ) και σχετίζονται με μειωμένη ποιότητα ζωής και αυξημένα ποσοστά θνησιμότητας. Παρόλο που η άσκηση αποτελεί την κύρια θεραπευτική στρατηγική που μετριάζει τις επιβλαβείς επιδράσεις της μυϊκής απώλειας στη ΧΑΠ, οι καχεκτικοί ασθενείς δεν παρουσιάζουν τον ίδιο βαθμό ικανότητας μυϊκής αναδιαμόρφωσης σε σύγκριση με τους μη καχεκτικούς ασθενείς με ΧΑΠ. Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία (ΕΘΟ) αποτελεί ένα δυναμικό και σύνθετο περιβάλλον που ανταποκρίνεται έντονα σε εξωτερικά ερεθίσματα. Επίσης, διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στη διατήρηση της δομικής ακεραιότητας του σκελετικού μυός και στον συντονισμό βασικών φυσιολογικών διεργασιών κατά την ανάπτυξη, την αναγέννηση και την αναδιαμόρφωσή του. Η ανισορροπία στη σύσταση της ΕΘΟ, η οποία μπορεί να προκύψει κατά τη γήρανση ή παρουσία παθολογικών μυϊκών καταστάσεων, έχει σημαντικές επιπτώσεις στη μυϊκή ομοιόσταση, λειτουργία και συνολική δομή. Αν και έχουν εντοπιστεί διάφοροι βιολογικοί μηχανισμοί που συμβάλλουν στη μυϊκή απώλεια που σχετίζεται με τη ΧΑΠ, η συμμετοχή της ΕΘΟ σε αυτή την κατάσταση παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. Υπόθεση: Διατυπώθηκε η υπόθεση ότι οι ασθενείς με ΧΑΠ θα παρουσιάζουν διακριτές μεταβολές στη σύσταση της ΕΘΟ του σκελετικού μυός σε σύγκριση με υγιή άτομα. Επιπλέον, υποτέθηκε ότι η ολοκλήρωση ενός προγράμματος άσκησης θα προκαλούσε διαφοροποιημένες προσαρμογές στην έκφραση της ΕΘΟ σε καχεκτικούς ασθενείς με ΧΑΠ σε σύγκριση με μη καχεκτικούς ασθενείς και υγιείς εθελοντές. Δεδομένου ότι το κάπνισμα αποτελεί τον σημαντικότερο παράγοντα ανάπτυξης της ΧΑΠ, αναμενόταν ότι θα επηρέαζε την έκφραση των συστατικών της ΕΘΟ στον σκελετικό μυ. Στόχοι: Η παρούσα μελέτη στόχευσε, για πρώτη φορά, στη διερεύνηση της σύστασης της ΕΘΟ στον σκελετικό μυ ασθενών με ΧΑΠ. Επιπλέον, επιδίωξε να προσδιορίσει εάν η άσκηση προκαλεί διαφοροποιημένες προσαρμοστικές αποκρίσεις στη σύσταση της ΕΘΟ μεταξύ καχεκτικών και μη καχεκτικών ασθενών με ΧΑΠ και υγιών ατόμων. Παράλληλα, επιχειρήθηκε η διερεύνηση πιθανών μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται σε αυτές τις προσαρμογές, προκειμένου να κατανοηθούν οι μηχανισμοί που ευθύνονται για την περιορισμένη προσαρμοστική ικανότητα των καχεκτικών μυών μετά από άσκηση. Επιπροσθέτως, μελετήθηκε η επίδραση της έκθεσης σε καπνό τσιγάρου και σε οξεία υποξία στην έκφραση των συστατικών της ΕΘΟ στον σκελετικό μυ. Τέλος, διερευνήθηκε η επίδραση ενός υποπροϊόντος του καπνού (κοτινίνη) στη μυογενή διαφοροποίηση, με σκοπό την καλύτερη κατανόηση της επίδρασης του καπνίσματος στη δυναμική της ΕΘΟ. Μεθοδολογία: Η μελέτη εξέτασε τη γονιδιακή και πρωτεϊνική έκφραση επιλεγμένων μορίων της ΕΘΟ σε βιοψίες του έξω πλατύ μηριαίου μυός (vastus lateralis) από 29 ασθενείς με ΧΑΠ [19 μη καχεκτικούς (FFMI >17 kg•m⁻²) και 10 καχεκτικούς (FFMI <17 kg•m⁻²)], καθώς και από 14 υγιείς εθελοντές, πριν και μετά από συμμετοχή σε πρόγραμμα άσκησης. Επιπλέον, διερευνήθηκε η επίδραση της έκθεσης σε καπνό τσιγάρου και σε οξεία υποξία στη γονιδιακή έκφραση της ΕΘΟ στον γαστροκνήμιο μυ ινδικών χοιριδίων. Περαιτέρω, χρησιμοποιήθηκε in vitro διαφοροποίηση μυοσωληναρίων C2C12 για την αξιολόγηση των επιδράσεων της κοτινίνης σε δείκτες ΕΘΟ, μυογένεσης και διαφοροποίησης. Η γονιδιακή έκφραση αξιολογήθηκε με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR), ενώ η πρωτεϊνική έκφραση προσδιορίστηκε με τη μέθοδο ανοσοπροσδιορισμού συνδεδεμένου με ένζυμο (ELISA). Αποτελέσματα: Αρχικά, οι ασθενείς με ΧΑΠ παρουσίασαν διακριτές μεταβολές στη μεταγραφή και μετάφραση βασικών μορίων της ΕΘΟ που σχετίζονται με τη δομή, αναγέννηση και επιδιόρθωση του μυός. Οι διαφορές μεταξύ μη καχεκτικών και καχεκτικών ασθενών παρατηρήθηκαν μόνο σε μεταγραφικό επίπεδο, με τους καχεκτικούς να εμφανίζουν μειωμένη μεταγραφική δραστηριότητα μορίων της ΕΘΟ. Μετά την άσκηση, παρατηρήθηκαν αντίθετες προσαρμογές μεταξύ των καχεκτικών ασθενών και των ομάδων με διατηρημένη μυϊκή μάζα, τόσο στην έκφραση της ΕΘΟ όσο και στους μυογενείς δείκτες. Αντιθέτως, οι μη καχεκτικοί ασθενείς και τα υγιή άτομα εμφάνισαν παρόμοια απόκριση στην άσκηση. Η ανάλυση φωσφο-κινασών έδειξε ότι η ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού p38 MAPK ενδέχεται να εμπλέκεται στην περιορισμένη ικανότητα αναδιαμόρφωσης που παρατηρείται στους καχεκτικούς ασθενείς μετά από άσκηση. Επιπλέον, η έκθεση σε καπνό τσιγάρου επηρέασε άμεσα τη σύσταση της ΕΘΟ στον σκελετικό μυ, ενώ η οξεία υποξία προκάλεσε επίσης μεταβολές αλλά μικρότερης έντασης. Τα in vitro αποτελέσματα έδειξαν ότι η παρουσία κοτινίνης ανέστειλε τη μυογενή και διαφοροποιητική ικανότητα των μυοβλαστών C2C12, καθώς και τη μεταγραφή μορίων της ΕΘΟ. Συμπεράσματα: Η μελέτη αυτή παρέχει νέα δεδομένα σχετικά με τις διαφοροποιήσεις στη βασική σύσταση της ΕΘΟ του σκελετικού μυός μεταξύ ασθενών με ΧΑΠ και υγιών ατόμων. Επιπλέον, τα ευρήματα αναδεικνύουν ότι η άσκηση προκαλεί διαφορετική απόκριση στην έκφραση των μορίων της ΕΘΟ στους καχεκτικούς ασθενείς με ΧΑΠ σε σύγκριση με τους μη καχεκτικούς και τα υγιή άτομα, παράλληλα με την ενίσχυση ενός γλυκολυτικού φαινοτύπου. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η ανισορροπία στη σύσταση της ΕΘΟ ενδέχεται να συμβάλλει στην περιορισμένη ικανότητα μυϊκής αναδιαμόρφωσης που παρατηρείται στους καχεκτικούς ασθενείς με ΧΑΠ μετά από άσκηση. Η στόχευση μορίων της ΕΘΟ θα μπορούσε να έχει θεραπευτική σημασία για την αντιμετώπιση της μυϊκής απώλειας στη ΧΑΠ.