Αξιολόγηση των μικρών μορίων RNA ως βιοδεικτών στην χρόνια Ηπατίτιδα Β

Abstract

Introduction: Around 240 million people, worldwide suffer from chronic hepatitis B. In most cases, chronic disease is well controlled due to treatment with nucleoside analogues (NAs), which block viral activity and effectively contribute to stabilizing the disease. However, treatment with NAs can often be interrupted, leading to a flare-up of the disease, with the gradual development of cirrhosis and, in many cases, the onset of hepatocellular carcinoma (HCC). Usually, NAs are a lifelong treatment for chronic hepatitis B patients. However, the oncogenic virulence of the virus often leads patients with CHB to develop cirrhosis and even HCC. Therefore, finding an indirect diagnostic marker for both the evaluation and discontinuation of treatment with NAs may be useful. One marker that can be detected in the circulation and can be used as an indirect marker of HBV transcriptional activity is pregenomic RNA (pgRNA). PgRNA is a template for the expression of reverse transcriptase (RT) and core proteins, while through reverse transcription it gives the negative strand of rcDNA. PgRNA, together with HBV poly and core proteins, is packaged in the endoplasmic reticulum into mature Dane-like virions. Studies using HBV pgRNA as a marker for the evaluation of chronic hepatitis B show that its use can satisfactorily predict the outcome of the disease. Furthermore, the pathophysiology of the liver microenvironment in chronic disease is an area that has not been adequately characterized, leaving gaps in our understanding of the action of innate immunity, while at the same time suggesting that the prevalence of dysfunctional T-lymphocytes is responsible for chronic inflammation. However, it is not only dysfunctional T-lymphocytes that exacerbate fibrosis, but also first-line defense cells, such as neutrophils. Neutrophils secrete chemotactic factors and enter the inflammatory microenvironment through tissue permeation, where they interact with other cells in the hepatic microenvironment. One of these cells is the platelet, which exerts a healing action through thrombosis, but in cases of inflammation, it appears that the phenomenon of immunothrombosis intensifies, causing the proliferation of hepatic stellate cells (HSCs) and worsening fibrosis. Considering the lack of literature on the inflammatory profile of chronic hepatitis B and the contribution of platelets to it, the aim of this PhD thesis is to investigate the transcriptomic profile of patients with chronic hepatitis B and to evaluate it in terms of innate immunity and platelet-neutrophil interactions regarding to the serological marker HBV pgRNA. Materials and Methods: A total of 88 chronic hepatitis B patients negative for HBeAg and undergoing treatment with NAs were examined. The samples collected were plasma, which was tested for all biochemical and virological markers of the virus, as well as for HBV pgRNA using the rt PCR method. The virus genotype was then determined and 8 samples were sequenced. All patients were negative for HBV DNA, 4 of them were positive for HBV pgRNA, while the rest were negative for it. These data were processedusing the bioinformatics tools: TrimGalore, fastp, Hisat2, HTseq, samtools, DESeq2, pheatmap, VennDiagram, and ggplot2. Next, the expression pathways of differentially expressed genes (|log2FC| ≥ 1 and p.adjusted < 0.05) were identified using GSEA performed with the bioinformatics tools: clusterProfiler and the GO (Gene Ontology) and KEGG (Kyoto Encyclopedia for Gene and Genome) databases. The above steps were performed for two different analyses. In the first analysis, chronic patients were compared with each other and with a group of healthy individuals for the presence of HBV pgRNA, while in the second analysis, data were extracted from patients with HBV-related HCC from the GSE57381 study and the chronic condition of the disease was compared with the HCC and the control group. The above analyses revealed common pathways for which experimental setups were organized, such as platelet activation with the serum of chronic patients positive and negative for HBV pgRNA. In addition, platelet-neutrophil interaction was studied, and immunofluorescence and rt PCR procedures were performed on both populations to determine the levels of interleukins IL-1b, IL-17A, the antimicrobial peptide LL-37, and the autophagy proteins BECLIN-1, LC3-B, and P62. Finally, the FIB-4 and PAGE-B indices were determined and evaluated for all samples for the progression of cirrhosis and the risk of developing HCC, respectively. Statistical analysis and the creation of predictive models were performed using SPSS 26.0 and R, where Student's t-test was used for similar variations, and the Mann-Whitney U test was used in the opposite case. Results: The percentage of chronic patients who tested positive for HBV pgRNA was 18.1%. The quantitative levels of HBV pgRNA show a statistically significant positive correlation with the ALT, AST, HBV DNA, HBsAg, and INR indicators, while they are negatively correlated with the duration of treatment. Patients who had been assessed with fibrosis index (Ishak ≥2) were less possible to be detected positive for the HBV pgRNA at the same time compared to patients who was in an early fibrosis stage, according to FIB-4 score. Regarding the first transcriptomic analysis, we identified 916 differentially expressed genes, of which 197 are common to both the HBV pgRNA-positive and HBV pgRNA-negative groups. These common genes appear to be involved in cellular processes such as autophagy and protein folding control, RNA regulation pathways, as well as pathways involved in platelet activation and innate immunity, such as neutrophil degranulation. In the second analysis, 3,215 differentially expressed genes were found, of which 329 are overexpressed in both groups and are common to CHB and HBV-related HCC. GSEA revealed pathways involved in cellular biogenesis processes, such as autophagy, apoptosis inhibition, RNA metabolism, and platelet activation, as well as neutrophil degranulation, which appear to be common with the first analysis. Based on the above pathways, platelets showed an increase in autophagy and their activation, which is consistent with thrombosis activation, as well asinteraction with neutrophils, which appear to follow the development of a pro-inflammatory phenotype. Furthermore, the presence of autophagy in platelets is evident from the increase of LC3-B levels and the antimicrobial peptide LL-37 under the presence of HBV pgRNA. However, the study of LL-37 activity showed neither antimicrobial nor fibrotic activity. The combined study of platelet-neutrophil interaction showed the development of a pro-inflammatory phenotype through high levels of IL-1b in neutrophils. However, while neutrophil elastase expression was observed, its detection was limited to the cytoplasm, resulting in a pro-netotic phenotype with minimal NETs in HBV pgRNA-positive conditions. Furthermore, the absence of IL-17A expression in neutrophils describes the absence of fibrosis, thus indicating a conservative proinflammatory state in the hepatic microenvironment of chronic hepatitis B patients. Conclusions: Despite the study of HBV pgRNA as an indirect marker for the termination of antiviral therapy, it appears that it may also be used as a marker for assessing the fibrotic profile of patients in the chronic phase. The study of the platelet-neutrophil communication axis showed that activated platelets in chronic patients can degranulate reactive factors. The use of neutrophils as mediator cells for platelet action has shown that there is a bidirectional interaction between them. Studying, the course of activation from platelets to neutrophils, it appears that a pro-inflammatory phenotype develops in neutrophils, which is maintained without the presence of fibrotic incidences like the secretion of IL-17A. This reveals a static pro-inflammatory phenotype without fibrotic actions, but ready to trigger them in situations of disease imbalance.As we showed in recent research, this pro-inflammatory phenotype evolves into an inflammatory one in patients with diagnosed cirrhosis, who are characterized by intense NET structures that release IL-1b into the extracellular space, as well as high levels of IL-17A. This confirms the fibrotic action of neutrophils in cirrhosis. Finally, our attempt to combine a viral marker of HBV transcriptional activity with disease progression has paved the way for further study of the platelet-neutrophil axis in chronic disease, but it remains to be determined whether HBV pgRNA is indeed the marker that triggers this intracellular interaction.

Εισαγωγή: Παγκοσμίως περίπου 240 εκατομμύρια άνθρωποι πάσχουν από χρόνια ηπατίτιδα Β. Τις περισσότερες φορές η χρόνια νόσος είναι καλά ελεγχόμενη, λόγω της θεραπευτικής αγωγής με νουκλεοσιδικά ανάλογα (NΑs), τα οποία μπλοκάρουν την ιική δραστηριότητα του ιού και συμβάλλουν αποτελεσματικά στην σταθεροποίηση της νόσου. Ωστόσο, πολλές φορές όταν η θεραπεία με τα NAs διακόπτεται μπορεί να οδηγήσει σε αναζωπύρωση της νόσου, με την σταδιακή ανάπτυξη, είτε κίρρωσης, είτε ηπατοκυτταρικού καρκινώματος (ΗΚΚ). Συνήθως τα NAs αποτελούν εσαεί θεραπεία της χρόνιας ηπατίτιδας Β, χωρίς να προβλέπεται ο τερματισμός τους . Έτσι λοιπόν η εύρεση ενός έμμεσου διαγνωστικού δείκτη, τόσο για την αξιολόγηση, όσο και για τον τερματισμό της θεραπείας με τα NAs μπορεί να φανεί χρήσιμη. Ένας δείκτης που ανιχνεύεται στην κυκλοφορία και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως έμμεσος δείκτης της μεταγραφικής δραστηριότητας του HBV είναι το pregenomic RNA (pgRNA). Το pgRNA αποτελεί εκμαγείο για την έκφραση της reverse transcriptase (RT) και των core πρωτεϊνών, ενώ μέσω της αντίστροφης μεταγραφής δίνει την αρνητική αλυσίδα του rcDNA. Το pgRNA μαζί με την HBV poly και τις core πρωτεΐνες συσκευάζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο σε ώριμα Dane λοιμογόνα σωματίδια. Μελέτες χρήσης του HBV pgRNA ως δείκτη αξιολόγησης της χρόνιας ηπατίτιδας Β δείχνουν πως η χρήση του μπορεί να προβλέψει ικανοποιητικά την έκβαση της νόσου . Επιπλέον, η παθοφυσιολογία του μικροπεριβάλλοντος του ήπατος σε καταστάσεις χρόνιας νόσου αποτελεί πεδίο που δεν έχει χαρακτηριστεί επαρκώς, αφήνοντας κενά σχετικά με την δράση της έμφυτης ανοσίας ενώ ταυτοχρόνως φαίνεται πως η επικράτηση δυσλειτουργικών T-λεμφοκυττάρων ευθύνεται για την χρόνια φλεγμονή. Ωστόσο, κύτταρα της πρώτης γραμμής άμυνας, όπως τα ουδετερόφιλα μπορούν επίσης να επιδεινώσουν την ίνωση. Τα ουδετερόφιλα εκκρίνοντας χυμειοεκλυτικούς παράγοντες προσέρχονται στο μικροπεριβάλλον της φλεγμονής μέσω διήθησης και αλληλεπιδρούν με άλλα κύτταρα του ηπατικού μικροπεριβάλλοντος. Ένα από αυτά τα κύτταρα είναι το αιμοπετάλιο το οποίο ασκεί επουλωτική δράση μέσω της θρόμβωσης, ωστόσο σε περιπτώσεις φλεγμονής φαίνεται πως το φαινόμενο της ανοσοθρόμβωσης εντείνεται προκαλώντας τον πολλαπλασιασμό των ηπατικών stellate cells (HSCs), επιδεινώνοντας την ίνωση. Λαμβάνοντας υπόψιν την έλλειψη βιβλιογραφίας σχετικά με το φλεγμονώδες προφίλ της χρόνιας ηπατίτιδας Β και την συμβολή του αιμοπεταλίου σε αυτήν, σκοπός της διδακτορικής αυτής εργασίας είναι να διερευνήσει το μεταγραφωμικό προφίλ των ασθενών με χρόνια ηπατίτιδα Β και να το αξιολογήσει με γνώμονα την έμφυτη ανοσία και τις κυτταρικές αλληλεπιδράσεις αιμοπεταλίου-ουδετερόφιλου, όσον αφορά τον ορολογικό δείκτη HBV pgRNA. Υλικά και Μέθοδοι: Συνολικά μελετήθηκαν 88 χρόνιοι ασθενείς με ηπατίτιδα B αρνητικοί για το HBeAg και υπό θεραπεία με NAs. Τα δείγματα που συλλέχθηκαν ήταν πλάσμα το οποίο ελέγχθηκε για όλους τους βιοχημικούς και ιολογικούς δέικτες του ιού, καθώς και για το HBV pgRNA μέσω της μεθόδου rt PCR. Στην συνέχεια, προσδιορίστηκε ο γονότυπος του ιού και πραγματοποιήθηκε αλληλούχηση 8 δειγμάτων. Όλοι οι ασθενείς ήταν αρνητικοί για το HBV DNA, οι 4 από αυτούς ήταν θετικοί για το HBV pgRNA, ενώ οι υπόλοιποι αρνητικοί γι’ αυτό. Τα δεδομένα αυτά αναλύθηκαν με τα βιοπληροφορικά εργαλεία: TrimGalore, fastp, Hisat2, HTseq, samtools, DESeq2, pheatmap, VennDiagram και ggplot2. Έπειτα, προσδιορίστηκαν τα μονοπάτια έκφρασης των διαφορικώς εκφραζόμενων γονιδίων (|log2FC| ≥ 1 και p.adjusted < 0.05) με την βοήθεια της GSEA ανάλυσης που πραγματοποιήθηκε με τα βιοπληροφορικά εργαλεία: clusterProfiler και τις βάσεις δεδομένων GO (Gene Ontology) και KEGG (Kyoto Encyclopedia for Gene and Genome). Τα παραπάνω βήματα πραγματοποιήθηκαν για δύο διαφορετικές αναλύσεις. Στην πρώτη ανάλυση συγκρίθηκαν οι χρόνιοι ασθενείς μεταξύ τους και με μία ομάδα υγιών για την παρουσία HBV pgRNA, ενώ στην δεύτερη ανάλυση αντλήθηκαν δεδομένα από ασθενείς με HBV-σχετιζόμενο HKK από την μελέτη GSE57381 και συγκρίθηκαν η χρόνια κατάσταση της νόσου με αυτήν του ΗΚΚ και της ομάδας ελέγχου. Από τις παραπάνω αναλύσεις βρέθηκαν κοινά μονοπάτια για τα οποία οργανώθηκαν πειραματικές διατάξεις, όπως η ενεργοποίηση αιμοπεταλίων με τον ορό των χρόνιων ασθενών θετικών και αρνητικών για το HBV pgRNA. Επιπλέον, μελετήθηκε και η αλληλεπίδραση τους με τα ουδετερόφιλα και πραγματοποιήθηκαν και στους δύο πληθυσμούς διαδικασίες ανοσοφθορισμού και rt PCR για τον προσδιορισμό των ιντερλευκινών IL-1b, IL-17A, του αντιμικροβιακού πεπτιδίου LL-37 και των πρωτεϊνών της αυτοφαγίας BECLIN-1, LC3-B, και P62. Τέλος, προσδιορίστηκαν και αξιολογήθηκαν για όλα τα δείγματα οι δείκτες FIB-4 και PAGE-B για την πορεία της κίρρωσης και τον κίνδυνο ανάπτυξης HKK, αντίστοιχα. Η στατιστική ανάλυση και η δημιουργία των προγνωστικών μοντέλων έγιναν με την βοήθεια των SPSS 26.0 και της R, όπου για όμοιες διακυμάνσεις χρησιμοποιήθηκε το Student’s t-test, ενώ σε αντίθετη περίπτωση το Mann-Whitney U test. Αποτελέσματα: Το ποσοστό των χρόνιων ασθενών που βρέθηκαν θετικοί στο HBV pgRNA ήταν 18,1%. Τα ποσοτικά επίπεδα του HBV pgRNA εμφανίζουν στατιστικά σημαντική θετική σχέση με τους δείκτες ALT, AST, HBV DNA, HBsAg, INR, ενώ αυτά σχετίζονται αρνητικά με την διάρκεια της θεραπείας. Ασθενείς με προχωρημένο ινωτικό στάδιο (Ishak ≥2) εμφάνισαν μικρότερη πιθανότητα ανίχνευσης του HBV pgRNA κατά τη διάρκεια της θεραπείας σε σύγκριση με ασθενείς με ήπια ίνωση σύμφωνα με το προγνωστικό μοντέλο FIB-4. Όσον αφορά την πρώτη μεταγραφωμική ανάλυση καταλήξαμε σε 916 διαφορικώς εκφραζόμενα γονίδια από τα οποία τα κοινά γονίδια μεταξύ των ομάδων HBV pgRNA-θετικών και HBV pgRNA-αρνητικών είναι 197. Από τα κοινά αυτά γονίδια φαίνεται να προκύπτουν μονοπάτια συμμετοχής τους σε κυτταρικές διεργασίες όπως η αυτοφαγία και ο πρωτεϊνικός έλεγχος ορθής αναδίπλωσης, μονοπάτια ρύθμισης του RNA, αλλά και μονοπάτια ενεργοποίησης αιμοπεταλίων και της έμφυτης ανοσίας, όπως η αποκοκκίωση των ουδετεροφίλων. Στην δεύτερη ανάλυση βρέθηκαν 3,215 διαφορικώς εκφραζόμενα γονίδια εκ των οποίων τα κοινά μεταξύ CHB και HBV-σχετιζόμενου ΗΚΚ είναι 329 υπερεκφραζόμενα και στις δύο ομάδες. Από την GSEA προέκυψαν μονοπάτια συμμετοχής τους σε κυτταρικές διαδικασίες βιογένεσης, όπως η αυτοφαγία, η αναστολή της απόπτωσης, ο μεταβολισμός του RNA και η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, καθώς και η αποκοκκίωση των ουδετερόφιλων, τα οποία φαίνεται να είναι κοινά με την πρώτη ανάλυση. Στην συνέχεια, η ύπαρξη του HBV pgRNA στον ορό αξιολογήθηκε για την συμμετοχή του στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και στην συνομιλία τους με τα ουδετερόφιλα. Στα αιμοπετάλια φαίνεται πως η παρουσία του HBV pgRNA ενεργοποιεί την αυτοφαγία, ενώ σε διατάξεις αλληλεπίδρασης με τα ουδετερόφιλα, φαίνεται να ενεργοποιείται ο προφλεγμονώδης φαινοτύπος. Συγκεκριμένα στα αιμοπετάλια παρατηρείται αύξηση των επιπέδων της LC3-Β υπό την παρουσία του HBV pgRNA, καθώς επίσης και της παραγωγής του αντιμικροβιακού πεπτιδίου LL-37. Ωστόσο, η μελέτη της δραστικότητάς του LL-37 δεν έδειξε ούτε αντιμικροβιακή, ούτε ινωτική δράση. Η συνδυαστική μελέτη της επικοινωνίας του αιμοπεταλίου με το ουδετερόφιλο έδειξε την ανάπτυξη προφλεγμονώδους φαινοτύπου μέσα από τα υψηλά επίπεδα της IL-1b στα ουδετερόφιλα. Ωστόσο, ενώ παρατηρήθηκε η έκφραση ουδετεροφιλικής ελεστάσης η ανίχνευσή της περιορίστηκε σε επίπεδο κυτταροπλάσματος αποδίδοντας έναν προνετωτικό φαινότυπο με ελάχιστες νετωτικές δομές στους HBV pgRNA-θετικούς. Επιπλέον, η απουσία έκφρασης της IL-17A στα ουδετερόφιλα, περιγράφει την απουσία ίνωσης, υποδεικνύοντας έτσι μία συντηρημένη προφλεγμονώδη κατάσταση στο ηπατικό μικροπεριβάλλον των χρόνιων ασθενών με ηπατίτιδα Β. Συμπεράσματα: Η μελέτη του HBV pgRNA ως έμμεσου δείκτη για τον τερματισμό της αντιικής θεραπείας φαίνεται πως μπορεί να χρησιμοποιηθεί και ως δείκτης αξιολόγησης της φλεγμονής στο ήπαρ σε ασθενείς σε χρόνια φάση. Η μελέτη του άξονα επικοινωνίας αιμοπετάλιο-ουδετερόφιλο έδειξε πως τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια στους χρόνιους ασθενείς έχουν την ικανότητα να αποκοκκιώνουν δραστικούς παράγοντες, χωρίς αυτοί να είναι άμεσα βιοενεργοί. Η χρήση του ουδετερόφιλου ως κυττάρου διαμεσολαβητή της δράσης του αιμοπεταλίου έχει δείξει πως υπάρχει μία αμφίδρομη αλληλεπίδραση μεταξύ τους. Αυτό που παρατηρήσαμε ήταν η ανάπτυξη προφλεγμονώδους κατάστασης στα ουδετερόφιλα μετά από διέγερση με ενεργοποιημένα αιμοπετάλια από ασθενείς που βρίσκονται σε χρόνια φάση. Έτσι φαίνεται να υπάρχει μία δυναμική προφλεγμονώδης κατάσταση, η οποία σταδιακά εξελίσσεται σε φλεγμονώδη και ινωτική σε ασθενείς με κίρρωση, όπως δείξαμε και σε πρόσφατη έρευνα. Συγκεκριμένα, η αδυναμία των αιμοπεταλίων να εξάγουν λειτουργικά μόρια LL-37, καθώς και η απουσία παραγωγής IL-17A σε συνδυασμό με την ύπαρξη IL-1b στα ουδετερόφιλα, αιτιολογούν την ύπαρξη ενός προφλεγμονώδους και όχι ινωτικού φαινοτύπου στους χρόνιους ασθενείς με θετικό HBV pgRNA. Τέλος, η προσπάθεια μας να συνδυάσουμε έναν ιικό δείκτη της μεταγραφικής δραστηριότητας του HBV με την εξέλιξη της νόσου έχει ανοίξει τον δρόμο για περαιτέρω μελέτη του άξονα αιμοπετάλιο-ουδετερόφιλο στην χρόνια νόσο, ωστόσο μένει να αποφανθούμε αν τελικά το HBV pgRNA είναι αυτός καθ’ αυτός ο δείκτης, που πυροδοτεί αυτήν την ενδοκυττάρια αλληλεπίδραση.