Ανάλυση μικροβιώματος κοπράνων σε ασθενείς με λοίμωξη από Clostridioides Difficile

Abstract

OBJECTIVES Clostridium difficile infection (CDI) presents with great heterogeneity whereas its final outcome cannot easily be predicted. We investigated the significance of the genetic background of the host, fecal microbiome, and Pancreatic Stone Protein (PSP) for predisposition and final outcome of CDI. METHODS The study consistied of two stages. In the first stage, DNA and serum were isolated from the peripheral blood of 134 patients with CDI and 134 controls with the same Charlson’s comorbidity index. Genome wide association study was performed using the HumanCoreExome BeadChip Kit whereas concentrations of interleukin (IL)-6, IL-8 and eotaxin were measured in serum by an enzyme immunoassay. Fecal microbiome analysis was also conducted. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) that can be included in a genetic score for CDI predisposition were depicted after step-wise logistic regression analysis. Clinical data, measured cytokines and SNPs and fecal bacterial species different among patients with favorable and unfavorable outcome were included in a prognostic score. In the second stage, PSP levels were measured in patients with CDI from 13 hospitals across Greece. Unfavorable outcome was defined as the progression into organ dysfunction or/and relapse after treatment and/or death. RESULTS During the first stage, 17 SNPs were associated with CDI fourteen of which ((rs12148744, rs714024, rs721059, rs4311028, rs62183547, rs1128266, rs4279595, rs175006, rs3859214, rs7222870, rs5086600, rs7240534, rs20911172, rs17680671) were included in the genetic score; values greater than 10 provided >80% positive predictive value (PPV) for CDI. Hemoglobin lower than 9.5 g/dl, urea greater than 64.5 mg/dl, IL-8 greater than 227 pg/ml and the presence of one G allele of rs2091172 and the presence of Terrisporobacter glycolycus, Enterococcus avium, or Anaerovax odorimutans in stool were included in the prognosis score, which demonstrated a sensitivity of 84.6% and a specificity of 95.8% for early prediction of unfavorable outcome. In the secod stage, 147 patients were analyzed, of whom 57 experienced unfavorable outcome. PSP levels were significantly higher in these patients, with an area under the curve (AUC) of 0.648 (95% confidence interval (CI) 0.550-0.746, p: 0.003) for predicting unfavorable outcome. The optima cut-off value was 300 ng/mL, which was associated with a significantly increased risk (odds ratio (OR) 3.73, 95% CI 1.822-7.638, p < 0.00001). The combination of elevated PSP and C-reactive protein (CRP) provided stronger prognostic value (OR 7.04, 95% CI 2.78-17.85, p < 0.001). In multivariable analysis, PSP ≥300 ng/mL (p: 0.006) and CRP ≥90 mg/L (p: 0.04) remained independent risk factors for unfavorable outcome. CONCLUSIONS A personalized score for the outcome of CDI is described for the first time, as well as the evaluation of PSP in patients with CDI. The score and PSP – particularly when combined with CRP - may guide treatment decision-making.

ΣΚΟΠΟΣ Οι λοιμώξεις από Clostridium difficile (CDI) παρουσιάζουν μεγάλη ετερογένεια ενώ η τελική έκβασή τους δε δύναται πολλές φορές να προβλεφθεί. Διερευνήθηκε η σημασία του γενετικού υπoστρώματος του ξενιστή, του μικροβιώματος των κοπράνων καθώς και της Pancreatic Stone Protein (PSP) στην προδιάθεση αλλά και στην τελική έκβαση της CDI. ΜΕΘΟΔΟΙ Η μελέτη αποτελείται από δύο στάδια. Στο πρώτο στάδιο δείγματα γενετικού υλικού και ορού απομονώθηκαν από το αίμα 134 ασθενών με CDI και 134 μαρτύρων με ίδιο δείκτη συνοσηροτήτων του Charlson. Έγινε μελέτη συσχετισμού ολόκληρου του γονιδιώματος (GWAS) με το HumanCoreExome BeadChip Kit. Οι συγκεντρώσεις της ιντερλευκίνης (IL)-6, της IL-8 και της εοταξίνης προσδιορίσθηκαν στον ορό με ανοσοενζυμική μέθοδο. Τέλος έγινε ανάλυση του μικροβιώματος των κοπράνων. Μετά από πολυπαραγοντική ανάλυση κατά στάδια ανιχνεύθηκαν οι μονήρεις νουκελοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNPs) που μπορούν να συμμετέχουν σε γονιδιακή βαθμολογία για την εκδήλωση CDI. Τα κλινικά δεδομένα, οι κυτταροκίνες, οι SNPs και τα βακτηριακά είδη στα κόπρανα που διέφεραν μεταξύ ασθενών με ευνοϊκή και δυσμενή έκβαση αποτέλεσαν τη βαθμολογία πρόγνωσης. Κατά το δεύτερο στάδιο, μετρήθηκαν τα επίπεδα της PSP από δείγματα ασθενών με CDI από 13 νοσοκομεία της Ελλάδος, με πρωτογενές καταληκτικό σημείο τη συσχέτιση της PSP και δυσμενούς έκβασης. Η δυσμενής έκβαση ορίσθηκε ως η εκδήλωση οργανικής ανεπάρκειας ή/και υποτροπής μετά τη θεραπεία ή/και ο θάνατος. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κατά το πρώτο στάδιο ανευρέθηκαν 17 SNPs που συνδέθηκαν με CDI εκ των οποίων οι δεκατέσσερις (rs12148744, rs714024, rs721059, rs4311028, rs62183547, rs1128266, rs4279595, rs175006, rs3859214, rs7222870, rs5086600, rs7240534, rs20911172, rs17680671) αποτέλεσαν τη γονιδιακή βαθμολογία της οποίας τιμές μεγαλύτερες από 10 είχαν θετική προγνωστική αξία >80% για CDI. Τιμές αιμοσφαιρίνης μικρότερες από 9,5 g/dl, ουρίας μεγαλύτερες από 64,5 mg/dl, IL-8 μεγαλύτερες από 227 pg/ml, η παρουσία του G αλλήλιου του rs2091172, και η παρουσία οποιουδήποτε εκ των Terrisporobacter glycolycus, Enterococcus avium και Anaerovorax odorimutans στα κόπρανα διαμόρφωσαν τη βαθμολογία πρόγνωσης, η οποία είχε ευαισθησία 84,6% και ειδικότητα 95,8% για πρώιμη πρόβλεψη δυσμενούς έκβασης. Κατά το δεύτερο στάδιο, αναλύθηκαν 147 ασθενείς, εκ των οποίων 57 είχαν δυσμενή έκβαση. Τα επίπεδα της PSP ήταν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα στους ασθενείς αυτούς με AUC 0.648 (95% διαστήματα εμπιστοσύνης (ΔΕ) 0.550-0.746, p: 0.003) για την πρόβλεψη δυσμενούς έκβασης, με βέλτιστο διαχωριστικό όριο τα 300 ng/ml, το οποίο αύξησε σημαντικά τον κίνδυνο (λόγος πιθανοτήτων (OR) 3.73, 95% CI 1.822-7.638, p<0.0001). Ο συνδυασμός αυξημένων PSP και CRP παρείχε ισχυρότερη προγνωστική αξία (OR 7.04, 95% ΔΕ 2.78-17.85, p<0.001). Στην πολυπαραγοντική ανάλυση, PSP ≥300 ng/ml (p: 0.006) και CRP ≥90 mg/L (p: 0.04) παρέμειναν ανεξάρτητοι παράγοντες κινδύνου για δυσμενή έκβαση. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Περιγράφεται για πρώτη φορά προσωποποιημένη βαθμολογία έκβασης και αξιολόγηση της PSP στη CDI. Ο δείκτης αυτός, καθώς και η PSP, ιδιαίτερα σε συνδυασμό με τη CRP, μπορεί εγκαίρως να κατευθύνει την επιλογή θεραπείας.