Regulation of bone morphogenetic growth factor bioavailability by the extracellular matrix

Abstract

Bone morphogenetic proteins (BMPs) belong to the TGF-β superfamily of pluripotent growth factors that exert several critical cellular functions such as proliferation, differentiation, and apoptosis during development and tissue homeostasis. Although originally discovered as extractable cytokines from bone matrix, it has not been investigated how the extracellular matrix controls their bioavailability. Gaining a better understanding about the molecular requirements controlling BMP activity within extracellular tissue microenvironments is crucial for new therapeutic advances in connective tissue disease and tissue regeneration. BMPs are synthesized as single chain precursors consisting of a prodomain (PD) and a growth factor (GF) moiety that are processed by proproteinconvertases (PPCs) to form a non-covalently associated PD-GF complex (CPLX). By employing transmission electron microscopy (TEM) with single particle averaging, molecular docking and bioactivity assays, it was discovered that PPC processing induces a conformational change that renders BMP-10 CPLX signaling-competent. Since BMP-10 predominantly circulates in human plasma as an unprocessed variant, its bioactivity can thus be regulated by the availability of PPCs within the extracellular space. In addition, the ECM can regulate BMP bioactivity by specific PD mediated targeting of BMP CPLXs to the microfibril component fibrillin-1. It was shown previously that the bioactive V-shape of BMP-7 CPLX assumes a latent, closed-ring conformation when targeted to fibrilin-1. In contrast, by employing negative staining EM and bioactivity assays on solid phase, it could be demonstrated that BMP-7 and BMP-9 CPLX targeting to heparin/ HS maintains their bioactive state. Molecular modeling, docking and heparin binding studies pointed towards conserved heparin/ HS bindingepitopes residing within the PD arm regions. In order to shed light into activation mechanisms of the fibrillin-bound BMPs, a cleavage screen using several matrix metalloproteinases (MMPs), combined with Edman sequencing and mutagenesis were employed that pointed towards a conserved PD cleavage consensus. By employing bioactivity assays, EM with single particle averaging and native PAGE it was found that MMP-13 releases bioactive GF leading to CPLX unfolding. In summary, this thesis provides a comprehensive analysis of different mechanisms utilized by the ECM to control BMP bioactivity in distinct extracellular microenvironments.

Οι οστικές μορφογενετικές πρωτεΐνες ανήκουν στην υπεροικογένεια των μετασχηματιστικών αυξητικών παραγόντων-βήτα των πολυδύναμων αυξητικών παραγόντων που ασκούν διάφορες κρίσιμες κυτταρικές λειτουργίες, όπως ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και η απόπτωση, κατά την ανάπτυξη και την ομοιόσταση των ιστών. Αν και αρχικά ανακαλύφθηκαν ως εκχυλίσιμες κυτταροκίνες από τη μήτρα των οστών, δεν έχει διερευνηθεί πώς η εξωκυττάρια μήτρα ελέγχει τη βιοδιαθεσιμότητά τους. Η καλύτερη κατανόηση των μοριακών απαιτήσεων που ρυθμίζουν τη δραστικότητα των οστικών μορφογενετικών πρωτεϊνών μέσα στα εξωκυττάρια μικροπεριβάλλοντα των ιστών είναι καθοριστική για νέες θεραπευτικές προόδους στις παθήσεις του συνδετικού ιστού και στην αναγέννηση ιστών. Οι οστικές μορφογενετικές πρωτεΐνες συντίθενται ως πρόδρομες πρωτεΐνες μίας αλυσίδας που αποτελείται από μια προδομική περιοχή και μια δομική περιοχή αυξητικού παράγοντα, οι οποίες υφίστανται επεξεργασία από προπρωτεϊνικές κονβερτάσες ώστε να σχηματίσουν ένα μη ομοιοπολικά συνδεδεμένο σύμπλοκο προδομικής περιοχής-αυξητικού παράγοντα. Με τη χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης με μέσο όρο μεμονωμένων σωματιδίων, μοριακής ψηφιακής πρόσδεσης και δοκιμασιών βιοενεργότητας, διαπιστώθηκε ότι η επεξεργασία από προπρωτεϊνικές κονβερτάσες επάγει μια δομική αλλαγή που καθιστά το σύμπλοκο οστικής μορφογενετικής πρωτεϊνης-10 ικανό για σηματοδότηση. Δεδομένου ότι η οστική μορφογενετική πρωτεΐνη-10 κυκλοφορεί κυρίως στο ανθρώπινο πλάσμα ως μη επεξεργασμένη μορφή, η βιοενεργότητά της μπορεί συνεπώς να ρυθμίζεται από τη διαθεσιμότητα των προπρωτεϊνικών κονβερτασών στον εξωκυττάριο χώρο. Επιπλέον, η εξωκυττάρια μήτρα μπορεί να ρυθμίζει τη βιοενεργότητα των οστικών μορφογενετικών πρωτεϊνών μέσω ειδικής στόχευσης των συμπλόκων οστικών μορφογενετικών πρωτεϊνών από την προδομική περιοχή στο μικροϊνιδιακό στοιχείο φιμπριλλίνη-1. Έχει δειχθεί προηγουμένως ότι το βιοενεργό σχήμα ανοικτής δομής του συμπλόκου της οστικής μορφογενετικής πρωτεΐνης-7 υιοθετεί μια λανθάνουσα, κλειστή δομή δακτυλίου όταν στοχεύεται στη φιμπριλλίνη-1. Αντίθετα, με τη χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας αρνητικής χρώσης και δοκιμασιών βιοενεργότητας σε στερεά φάση, αποδείχθηκε ότι η στόχευση των συμπλόκων των οστικών μορφογενετικών πρωτεϊνών-7 και -9 σε ηπαρίνη/ θειική ηπαράνη διατηρεί τη βιοενεργή τους κατάσταση. Μελέτες μοριακής μοντελοποίησης, μοριακής ψηφιακής πρόσδεσης και πρόσδεσης σε ηπαρίνη υπέδειξαν την ύπαρξη συντηρημένων επιτόπων δέσμευσης ηπαρίνης/ θειικής ηπαράνης που εντοπίζονται στις περιοχές των βραχιόνων της προδομικής περιοχής. Προκειμένου να διερευνηθούν οι μηχανισμοί ενεργοποίησης των οστικών μορφογενετικών πρωτεϊνών που είναι προσδεμένες στη φιμπριλλίνη, πραγματοποιήθηκε έλεγχος πρωτεόλυσης με διάφορες μεταλλοπρωτεάσες της εξωκυττάριας μήτρας, σε συνδυασμό με την αποικοδόμηση κατά Έντμαν και μεταλλαξιγένεση, τα οποία ανέδειξαν μια συντηρημένη θέση πρωτεόλυσης στην προδομική περιοχή. Με τη χρήση δοκιμασιών βιοενεργότητας, ηλεκτρονικής μικροσκοπίας με μέσο όρο μεμονωμένων σωματιδίων και ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες, διαπιστώθηκε ότι η μεταλλοπρωτεάση της εξωκυττάριας μήτρας-13 απελευθερώνει βιοενεργό αυξητικό παράγοντα, οδηγώντας σε ξεδίπλωμα του συμπλόκου. Συνολικά, η παρούσα διατριβή παρέχει μια ολοκληρωμένη ανάλυση των διαφορετικών μηχανισμών που χρησιμοποιεί η εξωκυττάρια μήτρα για τον έλεγχο της βιοενεργότητας των οστικών μορφογενετικών πρωτεϊνών σε διακριτά εξωκυττάρια μικροπεριβάλλοντα.