Study of the structural and biochemical properties and the regulatory mechanisms of human glutamate dehydrogenases

Abstract

Introduction : Glutamate dehydrogenase (GDH) is a mitochondrial enzyme that catalyzes the reversible interconversion of L-glutamate and α-ketoglutarate, thereby linking amino acid metabolism with the tricarboxylic acid cycle, cellular energy balance, and nitrogen homeostasis. In humans, two functional GDH isoenzymes exist: hGDH1, encoded by the ubiquitously expressed GLUD1 gene, and hGDH2, encoded by the X-linked GLUD2 gene. The latter arose through retrotransposition during primate evolution and exhibits a restricted tissue distribution, primarily in the brain, testis, and kidney. Despite sharing approximately 97% amino acid sequence identity, the two isoenzymes display markedly distinct regulatory and enzymatic properties. Importantly, genetic variants affecting GDH activity have been implicated in metabolic disorders, neurodegenerative diseases, and neoplastic processes. Understanding the structural and evolutionary basis of hGDH2 regulation is therefore essential for elucidating its physiological role and pathological significance. Aims : The primary aim of this study was to elucidate the structural, biochemical, and evolutionary mechanisms underlying the distinctive regulatory properties of human GDH isoenzymes, with emphasis on hGDH2. Specific objectives were: to characterize structure/function relationships responsible for hGDH2’s low basal activity, resistance to GTP inhibition, and regulation by ADP and L-leucine to investigate the functional evolution of hGDH2 through reconstruction and analysis of evolutionary intermediates to identify potential isoenzyme-specific regulators through in silico screening and enzymatic validation. Methods Recombinant wild-type hGDH1, hGDH2, and selected evolutionary variants were expressed in SF9 insect cells using a baculovirus expression system. Proteins were purified through sequential ammonium sulfate precipitation followed by hydrophobic interaction and hydroxyapatite chromatography. Enzymatic activity was assessed using kinetic assays measuring basal activity, allosteric regulation by ADP, GTP, and L-leucine, thermal stability, and sensitivity to steroidal inhibitors. Computational analyses included AlphaFold-based structural prediction, mutational and intramolecular interaction analysis, and molecular docking of candidate regulatory compounds. Selected docking hits were further evaluated using kinetic assays. Results: AlphaFold-predicted models closely matched experimentally determined GDH structures, enabling reliable reconstruction of the structural evolution of GDH2. Comparative analyses revealed that the earliest evolutionary step following GLUD2 emergence represented the most critical divergence toward the modern hGDH2 phenotype. Functional characterization of ancestral (1st evolutionary step) and primate (Gibbon) GDH2 variants demonstrated that resistance to GTP inhibition and strong ADP-mediated activation were established early during evolution. In contrast, reduced basal activity, increased heat lability, and enhanced sensitivity to steroid-mediated inhibition emerged at later evolutionary stages. Docking-based screening identified several dicarboxylic acid compounds with favorable predicted pharmacokinetic properties; however, enzymatic assays did not reveal strong inhibitory activity under the conditions tested. Discussion: This study provides an integrated structural and functional framework explaining how a small number of coordinated amino acid substitutions conferred distinct regulatory properties upon hGDH2 during primate evolution. Early acquisition of GTP resistance and ADP responsiveness suggests adaptive tuning of GDH2 to energy-demanding cellular environments, particularly in the brain. Later-emerging features, including low basal activity and thermal lability, likely further refined isoenzyme regulation. Although no potent hGDH2-specific inhibitors were identified, the findings highlight critical regulatory regions that may serve as future therapeutic targets. Overall, this work advances understanding of GDH isoenzyme specialization and its relevance to human metabolism and disease.

Εισαγωγή : Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH) είναι ένα μιτοχονδριακό ένζυμο που καταλύει την αναστρέψιμη μετατροπή του L-γλουταμικού σε α-κετογλουταρικό, συνδέοντας τον μεταβολισμό των αμινοξέων με τον κύκλο του τρικαρβοξυλικού οξέος, την κυτταρική ενεργειακή ισορροπία και την ομοιόσταση του αζώτου. Στον άνθρωπο υπάρχουν δύο λειτουργικά ισοένζυμα της GDH: η hGDH1, που κωδικοποιείται από το γονίδιο GLUD1 και εκφράζεται σχεδόν σε όλους τους ιστούς, και η hGDH2, που κωδικοποιείται από το Χ-συνδεδεμένο γονίδιο GLUD2. Το τελευταίο προέκυψε μέσω ρετρομετάθεσης κατά την εξέλιξη των πρωτευόντων και παρουσιάζει περιορισμένη ιστική κατανομή, κυρίως στον εγκέφαλο, στους όρχεις και στους νεφρούς. Παρά την υψηλή ομολογία της αμινοξικής τους αλληλουχίας (~97%), τα δύο ισοένζυμα εμφανίζουν σημαντικά διαφορετικές ιδιότητες. Επιπλέον, γενετικές παραλλαγές που επηρεάζουν τη δραστικότητα της GDH έχουν συσχετιστεί με μεταβολικές διαταραχές, νευροεκφυλιστικά νοσήματα και νεοπλασματικές διεργασίες. Η κατανόηση της δομικής και εξελικτικής βάσης της ρύθμισης της hGDH2 είναι επομένως κρίσιμη για τη διερεύνηση του φυσιολογικού και παθολογικού της ρόλου. Στόχοι : Κύριος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση των δομικών, βιοχημικών και εξελικτικών μηχανισμών που καθορίζουν τις ιδιαίτερες ρυθμιστικές ιδιότητες των ανθρώπινων ισοενζύμων της GDH, με έμφαση στην hGDH2. Οι ειδικοί στόχοι περιλάμβαναν: τον χαρακτηρισμό των σχέσεων δομής/λειτουργίας που ευθύνονται για τη χαμηλή βασική δραστικότητα της hGDH2, την ανθεκτικότητά της στην αναστολή από GTP και τη ρύθμισή της από ADP και L-λευκίνη τη μελέτη της λειτουργικής εξέλιξης της hGDH2 μέσω ανάλυσης ενδιάμεσων μορφώντην αναζήτηση δυνητικά ειδικών για το ισοένζυμο ρυθμιστών μέσω υπολογιστικών προσεγγίσεων και πειραματικής επιβεβαίωσης. Μέθοδοι Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες αγρίου τύπου hGDH1 και hGDH2, καθώς και επιλεγμένες εξελικτικές παραλλαγές, εκφράστηκαν σε κύτταρα SF9 με χρήση του συστήματος έκφρασης baculovirus. Ο καθαρισμός των πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε με διαδοχική κατακρήμνιση με θειικό αμμώνιο και χρωματογραφία υδρόφοβης αλληλεπίδρασης και υδροξυαπατίτη. Η ενζυμική δραστικότητα αξιολογήθηκε με κινητικές δοκιμασίες που αφορούσαν τη βασική δραστικότητα, τη ρύθμιση από ADP, GTP και L-λευκίνη, τη θερμική σταθερότητα και την ευαισθησία σε στεροειδείς αναστολείς. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκαν υπολογιστικές αναλύσεις με χρήση προβλέψεων δομής μέσω AlphaFold, ανάλυση μεταλλάξεων και ενδομοριακών αλληλεπιδράσεων, καθώς και μοριακή πρόσδεση υποψήφιων ρυθμιστικών ενώσεων. Επιλεγμένα μόρια αξιολογήθηκαν περαιτέρω με κινητικές δοκιμασίες. Αποτελέσματα : Τα δομικά μοντέλα που προέκυψαν από το AlphaFold παρουσίασαν υψηλή συμφωνία με τις πειραματικά προσδιορισμένες δομές της GDH, επιτρέποντας την αξιόπιστη ανασύσταση της δομικής εξέλιξης της GDH2. Η συγκριτική ανάλυση έδειξε ότι το πρώτο εξελικτικό στάδιο μετά την εμφάνιση του GLUD2 αποτέλεσε το πλέον καθοριστικό σημείο απόκλισης προς το σύγχρονο φαινότυπο της hGDH2. Η λειτουργική μελέτη των εξελικτικών ενδιάμεσων (πρώτο εξελικτικό βήμα) και της GDH2 από ένα σύγχρονο πρωτεύον (γίβονα) κατέδειξε ότι η ανθεκτικότητα στην αναστολή από GTP και η ισχυρή ενεργοποίηση από ADP εγκαθιδρύθηκαν πρώιμα κατά την εξέλιξη. Αντιθέτως, η μειωμένη βασική δραστικότητα, η αυξημένη θερμική αστάθεια και η ενισχυμένη ευαισθησία στη στεροειδική αναστολή εμφανίστηκαν σε μεταγενέστερα εξελικτικά στάδια. Η υπολογιστική διαλογή δικαρβοξυλικών ενώσεων ανέδειξε υποψήφια μόρια με ευνοϊκές φαρμακοκινητικές ιδιότητες, χωρίς ωστόσο να παρατηρηθεί ισχυρή ενζυμική αναστολή. Συζήτηση : Η παρούσα μελέτη προσφέρει ένα ολοκληρωμένο δομικό και λειτουργικό πλαίσιο που εξηγεί πώς ένας περιορισμένος αριθμός συντονισμένων αμινοξικών υποκαταστάσεων οδήγησε στην απόκτηση των ιδιαίτερων ρυθμιστικών χαρακτηριστικών της hGDH2 κατά την εξέλιξη των πρωτευόντων. Η πρώιμη εγκαθίδρυση της ανθεκτικότητας στο GTP και της ευαισθησίας στο ADP υποδηλώνει προσαρμοστική ρύθμιση της GDH2 σε περιβάλλοντα με αυξημένες ενεργειακές απαιτήσεις, όπως ο εγκέφαλος. Οι μεταγενέστερες ιδιότητες, όπως η χαμηλή βασική δραστικότητα και η θερμική αστάθεια, πιθανώς συνέβαλαν στη λεπτομερή ρύθμιση του ισοενζύμου. Αν και δεν εντοπίστηκαν ισχυροί ειδικοί αναστολείς της hGDH2, τα αποτελέσματα αναδεικνύουν κρίσιμες ρυθμιστικές περιοχές που μπορούν να αποτελέσουν μελλοντικούς θεραπευτικούς στόχους. Συνολικά, η εργασία αυτή ενισχύει την κατανόηση της λειτουργικής εξειδίκευσης των ισοενζύμων της GDH και της σημασίας τους στην ανθρώπινη φυσιολογία και παθολογία.