Identification and analysis of chromosome-organising-clamp sites in the budding yeast S. cerevisiae

Abstract

The three-dimensional spatial architecture of chromosomes is integrally connected to chromatin function. Budding yeast telomeres cluster at the nuclear periphery, the ribosomal genes are localised to the nucleolus, tRNA genes may also tend to localise to the nucleolus or centromeres, while the later cluster near the spindle pole body. Recently, in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, a novel role has been revealed for the RNA polymerase III transcriptional apparatus, and TFIIIC in particular, in chromosome spatial organisation and boundary function. In this project, I investigate whether Saccharomyces cerevisiae Extra TFIIIC (ETC) sites, which bind the TFIIIC transcription factor but do not recruit RNA polymerase III, act to position chromosomal domains. I show that six of the eight known S. cerevisiae ETC sites localise predominantly at the nuclear periphery. An ETC site retains its tethering function when moved to a new chromosomal location. TFIIIC binding is necessary for peripheral localisation, since deleting the TFIIIC binding consensus ablates ETC site peripheral positioning. I find that any of the six TFIIIC subunits can drive peripheral tethering, suggesting that the TFIIIC complex is central to the positioning mechanism. Interestingly, anchoring of ETC sites to the nuclear periphery also requires Mps3p, a Sad1-UNC-84 domain protein that spans the inner nuclear membrane. Moreover, I show that the mechanism of ETC site peripheral tethering requires chromatin remodelling proteins, and in particular Histone 3 - Lysine 56 (H3K56) acetylation. Finally, I investigate the biological function of ETC sites and examine the connection between this biological function and their ability to anchor at the nuclear periphery.In summary, TFIIIC and Mps3p together position a new class of genomic loci crucial for correct spatial organisation of S. cerevisiae chromosomes.

Η τρισδιάστατη χωρική αρχιτεκτονική των χρωμοσωμάτων συνδέεται άρρηκτα με τη λειτουργία της χρωματίνης. Στον ζυμομύκητα εκβλάστησης, τα τελομερή συσσωματώνονται στην πυρηνική περιφέρεια, τα ριβοσωμικά γονίδια εντοπίζονται στον πυρηνίσκο, ενώ τα γονίδια tRNA τείνουν επίσης να εντοπίζονται στον πυρηνίσκο ή στα κεντρομερίδια, τα οποία με τη σειρά τους συσσωματώνονται κοντά στο σωμάτιο της μιτωτικής ατράκτου. Πρόσφατα, στον σχιζομύκητα Schizosaccharomyces pombe, αποκαλύφθηκε ένας νέος ρόλος του μεταγραφικού μηχανισμού της RNA πολυμεράσης III, και ειδικότερα του TFIIIC, στη χωρική οργάνωση των χρωμοσωμάτων και στην οριοθετική λειτουργία της χρωματίνης. Στο παρόν έργο, διερευνώ κατά πόσο οι θέσεις Extra TFIIIC (ETC) του Saccharomyces cerevisiae, οι οποίες δεσμεύουν τον μεταγραφικό παράγοντα TFIIIC αλλά δεν προσλαμβάνουν την RNA πολυμεράση III, δρουν στην χωρική τοποθέτηση χρωμοσωμικών περιοχών. Δείχνω ότι έξι από τις οκτώ γνωστές θέσεις ETC του S. cerevisiae εντοπίζονται κυρίως στην πυρηνική περιφέρεια. Μια θέση ETC διατηρεί τη λειτουργία αγκύρωσής της ακόμη και όταν μεταφέρεται σε νέα χρωμοσωμική θέση. Η δέσμευση του TFIIIC είναι απαραίτητη για την περιφερειακή εντόπιση, καθώς η διαγραφή της συναινετικής αλληλουχίας πρόσδεσης του TFIIIC καταργεί την περιφερειακή τοποθέτηση της θέσης ETC. Διαπιστώνω ότι οποιαδήποτε από τις έξι υπομονάδες του TFIIIC μπορεί να προκαλέσει περιφερειακή αγκύρωση, γεγονός που υποδηλώνει ότι το σύμπλοκο TFIIIC είναι κεντρικό στον μηχανισμό τοποθέτησης. Είναι ενδιαφέρον ότι η αγκύρωση των θέσεων ETC στην πυρηνική περιφέρεια απαιτεί επίσης την Mps3p, μια πρωτεΐνη με Sad1-UNC-84 δομική περιοχή που διαπερνά την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη. Επιπλέον, δείχνω ότι ο μηχανισμός περιφερειακής αγκύρωσης των θέσεων ETC απαιτεί πρωτεΐνες αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης, και ειδικότερα την ακετυλίωση της ιστόνης 3 στη λυσίνη 56 (H3K56). Τέλος, διερευνώ τη βιολογική λειτουργία των θέσεων ETC και εξετάζω τη σχέση μεταξύ αυτής της λειτουργίας και της ικανότητάς τους να αγκυρώνονται στην πυρηνική περιφέρεια. Συνοψίζοντας, το TFIIIC και η Mps3p συνεργάζονται για την τοποθέτηση μιας νέας κατηγορίας γονιδιωματικών θέσεων που είναι κρίσιμες για τη σωστή χωρική οργάνωση των χρωμοσωμάτων του S. cerevisiae.