Molecular mechanisms underlying Retinitis pigmentosa type 2

Abstract

The term “Retinitis pigmentosa” (RP) represents a group of inherited, late-onset diseases characterised by progressive retinal degeneration due to photoreceptor death. Mutations in the RP2 gene are found in 7-18% of patients with X-linked RP, one of the most severe forms. The RP2 gene product is a membrane-associated protein which encompasses two distinct domains. The N-terminal domain is well characterised as possessing GTPase-activating protein (GAP) activity towards the small GTPase ARL3 and thus regulates the transport of lipid-modified proteins within the photoreceptor cell. However, it is not known if the loss of this particular function of RP2 is the sole reason that causes the disease, while the role of the protein’s C-terminus remains unknown. This thesis focuses on the characterisation of two novel protein-protein interactions of RP2 with the aim to investigate novel roles of the protein. Firstly, evidence is provided that a highly-conserved cluster of RP2 residues that span both the N- and C-terminus participate in direct interaction with Osteoclast-stimulating factor 1 (OSTF1). Two hypotheses are explored about the potential roleof the complex in SRC-mediated RP2 phosphorylation and the regulation of cell motility. Secondly, the catalytic subunit of DNA-dependent protein kinase (DNA PK) is identified as a novel interaction partner of RP2 in cultured cells. The two proteins are shown to co-localise in the nuclear and membrane compartments of a retinal-derived cell line and might engage in a kinase-substrate relationship. So far, no evidence has been found that RP2 participates in the canonical function of DNA PK, which is the regulation of DNA double-stranded breaks. Finally, the CRISPR/Cas9 genome editing method was applied on zebrafish embryos to generate a novel vertebrate animal model for the loss of RP2 function. One of three zebrafish lines with rp2 mutations showed, by histology, mild late-onset thinning of the photoreceptor outer segments. The present thesis reports previously unexplored aspects of RP2’s function and will therefore contribute to understanding the molecular mechanisms underlying RP. Moreover, this thesis will contribute to the discussion about the usefulness of zebrafish as an RP model.

Ο όρος «Μελαγχρωστική αμφιβληστροειδοπάθεια» περιγράφει μία ομάδα κληρονομικών παθήσεων που οδηγούν σε προοδευτική τύφλωση λόγω της εκφύλισης του αμφιβληστροειδούς. Σε ποσοστό 7-18% των ασθενών με τη φυλοσύνδετη μορφή της ασθένειας, εντοπίζονται παθογόνες παραλλαγές στο γονίδιο RP2. Το γονίδιο αυτό κωδικοποιεί για πρωτεΐνη της κυτταρικής μεμβράνης, το Ν-τελικό άκρο της οποίας συμμετέχει στη μεταφορά πρωτεϊνών μεταξύ των ενδοκυτταρικών οργανιδίων των φωτοϋποδοχέων, ενώ το C-τελικό άκρο έχει, μέχρι στιγμής, άγνωστη λειτουργία. Η παρούσα διατριβή στοχεύει στη διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών της εκφύλισης που πυροδοτείται από τις μεταλλάξεις του γονιδίου RP2, μέσω της μελέτης δύο νέων πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων της πρωτεΐνης RP2. Καταρχήν, εντοπίζεται η περιοχή της RP2 που συμμετέχει στο σχηματισμό συμπλόκου με την πρωτεΐνη Osteoclast-stimulating factor 1 (OSTF1) και αποδεικνύεται πως πρόκειται για περιοχή υψηλής εξελικτικής συντήρησης και περιλαμβάνει περιοχές τόσο του Ν-τελικού άκρου όσο και του C- τελικού άκρου. Παράλληλα, προτείνονται δύο πιθανές υποθέσεις για τη λειτουργία του συμπλόκου, συγκεκριμένα στη ρύθμιση της φωσφορυλίωσης της RP2 από την πρωτεϊνική κινάση Src καθώς και στη ρύθμιση της κυτταροσκελετικής δυναμικής. Στη συνέχεια, μελετάται η αλληλεπίδραση της RP2 με την πρωτεϊνική κινάση DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) και εξερευνάται η πιθανή σχέση κινάσης-υποστρώματος των δύο πρωτεϊνών. Ωστόσο, δεν θεωρείται πιθανό η RP2 να συμμετέχει στο πιο γνωστό μονοπάτι όπου δρα η DNA-PK, που είναι η επιδιόρθωση δίκλωνων θραυσμάτων του DNA, αλλά μάλλον σε κάποια εναλλακτική λειτουργία της DNA-PK που χρειάζονται περισσότερα πειράματα για να διευκρινιστεί. Τέλος, αναλύεται η δημιουργία ενός νέου ζωϊκού μοντέλου για τη μελαγχρωστική αμφιβληστροειδοπάθεια, μέσω της εφαρμογής της μεθόδου γενετικής επεξεργασίας CRISPR-Cas9 με σκοπό την απενεργοποίηση του γονιδίου rp2 σε έμβρυα ψαριού-ζέβρα. Στο συγκεκριμένο μοντέλο, η εκφύλιση του στρώματος των φωτοϋποδοχέων στον αμφιβληστροειδή ενήλικων ψαριών με συγκεκριμένη παθογόνο μετάλλαξη του γονιδίου rp2 γίνεται φανερή με τη χρήση μεθόδων ιστολογίας. Εν κατακλείδι, η παρούσα διατριβή συνεισφέρει στην προαγωγή της γνώσης σχετικά με τις λειτουργίες της πρωτεΐνης RP2 αλλά και της εκφύλισης του αμφιβληστροειδή γενικότερα, ενώ συμβάλει και στη συζήτηση για τη χρησιμότητα των ζωϊκών μοντέλων για τη μελέτη παθήσεων κληρονομικής τύφλωσης.