Βιοχημική ανάλυση ιστών με φασματοσκοπία Raman για τη μελέτη και την ανίχνευση του καρκίνου του παχέος εντέρου και της ασβεστοποίησης της αορτικής βαλβίδας

Abstract

In the present study, Raman spectroscopy is employed for the analysis of colorectal and aortic valve tissues, with the aim of highlighting its potential as a diagnostic tool for Colorectal Cancer (CRC) and Calcific Aortic Valve Disease (CAVD). Through detailed examination of Raman spectra, the study seeks to extract comprehensive molecular and structural information to capture the biochemical alterations characteristics of these pathologies. The experimental procedure involved the collection of large number of spectra using two Raman systems: a micro-Raman spectrometer and a portable Raman system equipped with a fiber-optic probe, both operating with a 785 nm laser source. The micro-Raman system enabled high-resolution analysis of tissue composition and the study of key regions such as tumor margins, while the portable spectrometer validated the main findings under conditions closer to a clinical environment. The primary objective of the CRC study was the spectral comparison between tissues from the central region of colorectal adenocarcinoma tumors and healthy intestinal samples. To this end, three experimental series were conducted: (a) ex vivo micro-Raman measurements on human tissues of size ~5x5x0.5 mm3, (b) in vivo measurements using the portable Raman system with probe in mice bearing tumors induced by injection of human colorectal cancer cells (HCT-116), and (c) measurements, using the portable Raman system, on human surgical specimens immediately after colectomy (“clinical-simulation measurements”). Tumor margins were further investigated through ex vivo micro-Raman spectra collected from peripheral and intermediate tissue zones to map the transition from healthy to cancerous tissue. Biochemical interpretation of the spectral signatures and identification of potential CRC Raman biomarkers were based on comparisons between cancerous and normal tissues using difference spectra, peak fitting, and t-tests for statistical significance. Cancerous tissues exhibited increased protein content, whereas normal tissues showed higher lipid-to-protein ratios and elevated collagen levels. Statistically significant differences (p < 0.001) were found in Raman peaks at 1004 cm⁻¹ (phenylalanine), 1341 cm⁻¹ (Amide III), and 1660 cm⁻¹ (Amide I), all increased in cancer, and at 855 cm⁻¹ (collagen), 1440 cm⁻¹ (proteins and lipids), and 2852 cm⁻¹ (lipids), all enhanced in normal tissues. PCA confirmed these biomarkers, and the same spectral alterations were observed both in the in vivo mouse experiments and in the clinical-simulation measurements on human samples. Peak-fitting analysis in the Amide I region indicated that α-helix structures dominate cancerous tissues, whereas β-sheet conformations dominate healthy tissues. Overall, normal colon tissue displayed greater spectral heterogeneity due to its complex structure and higher lipid and collagen content, while cancerous tissues were comparatively more spectrally homogeneous. To evaluate diagnostic performance, multivariate statistical approaches and machine learning classification models (PLS-DA and XGBoost) were applied. Both PLS-DA and XGBoost classifiers demonstrated satisfactory accuracy in the context of preclinical assessment, supporting the suitability of Raman spectroscopy for CRC detection. For micro-Raman spectra collected from tumor cores and healthy intestinal regions, PLS-DA achieved an accuracy of 76–86%, while XGBoost yielded slightly improved performance (78–86%). Raman probe measurements showed particularly high classification performance, with accuracies of 94–97% in clinical-simulation experiments on human tissues and 88–97% in in vivo mouse studies. Spectra from tumor margins exhibited features shared with both healthy and cancerous tissues, reflecting the heterogeneity of the transitional region. Significant differences were observed in protein-related bands (1004, 1658 cm⁻¹), collagen bands (855, 918, 943 cm⁻¹), and lipid bands (1448, 2852 cm⁻¹), while PLS-DA and XGBoost achieved 82% accuracy in margin recognition. The study of aortic valve tissues was conducted using micro-Raman spectroscopy and Raman mapping on thin sections 14–25 μm thick, aiming to identify and characterize the calcifications associated with CAVD. Human pathological tissues showed the presence of inorganic salts such as B-type carbonated hydroxyapatite (HA) (428, 961, 1071 cm⁻¹) and amorphous calcium carbonate (1081 cm⁻¹). Deconvolution of the 962 cm⁻¹ Raman band indicated that the calcifications consisted primarily of well-crystallized HA, with minor contributions from precursor phases such as amorphous calcium phosphate (ACP). Raman mapping accurately delineated hydroxyapatite nodules on the tissue surface, demonstrating the technique’s ability to capture morphological features of advanced calcification. CAVD tissues exhibited collagen overexpression, evident from enhanced collagen-related Raman bands (816, 855, 877, 921, 945 cm⁻¹), while the increased hydroxyproline-to-proline ratio (Hyp/Pro)—particularly in highly calcified samples—suggested reinforced collagen cross-linking potentially associated with fibrosis progression. Measurements on the rabbit disease model confirmed these findings and revealed additional features, such as the coexistence of HA with calcium pyrophosphate (960 and 1040 cm⁻¹) and other phosphate precursor phases (β-TCP, ACP, OCP) at advanced stages (7 weeks samples), as well as the likely presence of calcium carbonate (1070 and ~1080 cm⁻¹) at early stages (2 weeks samples). Additional measurements on pellet samples, obtained by centrifugation of homogenized valve tissues, demonstrated the presence of small quantities of HA or phosphate salts even at early disease stages, with a progressive increase in HA content throughout disease progression (0 → 2 → 4 → 7 weeks). The results confirm that Raman spectroscopy can reliably capture key biochemical alterations in CRC and CAVD, revealing characteristic spectral biomarkers and demonstrating strong diagnostic potential. The findings support further exploration of Raman-based approaches for future clinical applications.

Στην παρούσα μελέτη αξιοποιείται η φασματοσκοπία Raman για τη μελέτη ιστών παχέος εντέρου και αορτικών βαλβίδων, με στόχο την ανάδειξη των δυνατοτήτων της ως εργαλείο ανίχνευσης του Καρκίνου Παχέος Εντέρου και Ορθού (CRC) καθώς και της Ασβεστοποιού Στένωσης Αορτικών Βαλβίδων (CAVD). Μέσω διεξοδικής ανάλυσης των φασμάτων Raman επιδιώκεται η εξαγωγή όσο το δυνατόν πληρέστερης μοριακής και δομικής πληροφορίας, ώστε να αποτυπωθούν οι παθολογικές βιοχημικές αλλοιώσεις που χαρακτηρίζουν τις συγκεκριμένες παθήσεις. Η πειραματική διαδικασία περιελάμβανε τη συλλογή ενός μεγάλου όγκου φασμάτων με δύο συστήματα Raman: ένα φασματόμετρο micro-Raman και ένα φορητό σύστημα Raman με ενσωματωμένο Probe οπτικών ινών, αμφότερα με πηγή laser στα 785 nm. Το σύστημα micro-Raman επέτρεψε την ανάλυση της μοριακής σύνθεσης των ιστών σε μικροσκοπικό επίπεδο και τη μελέτη κρίσιμων περιοχών όπως τα όρια του όγκου, ενώ το φορητό φασματόμετρο χρησιμοποιήθηκε για την επιβεβαίωση των βασικών ευρημάτων σε μετρήσεις που προσεγγίζουν περισσότερο τις πραγματικές κλινικές συνθήκες. Βασικός στόχος της μελέτης του CRC ήταν η φασματοσκοπική σύγκριση ιστών από την κεντρική περιοχή όγκων αδενοκαρκινώματος με υγιή εντερικά δείγματα. Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν τρεις σειρές πειραμάτων: (α) ex vivo μετρήσεις micro-Raman σε ανθρώπινους ιστούς μεγέθους ~5x5x0,5 mm3, (β) in vivo μετρήσεις με το φορητό φασματόμετρο με Raman Probe σε ποντίκια όπου είχαν αναπτυχθεί όγκοι με έγχυση ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων παχέος εντέρου (HCT 116) και (γ) μετρήσεις με το φορητό φασματόμετρο σε ανθρώπινα δείγματα αμέσως μετά από την κολεκτομή στο χειρουργείο («προσομοίωση κλινικής εφαρμογής»). Επιπλέον, διερευνήθηκαν τα όρια των όγκων μέσω συλλογής ex vivo φασμάτων micro-Raman από περιφερειακές και ενδιάμεσες ζώνες ιστών, με στόχο την αποτύπωση της μετάβασης από τον υγιή στον καρκινικό ιστό. Η βιοχημική ερμηνεία των φασματικών αποτυπωμάτων και ο εντοπισμός πιθανών φασματικών βιοδεικτών του καρκίνου βασίστηκαν στη σύγκριση καρκινικών και φυσιολογικών ιστών μέσω φασμάτων διαφοράς, προσαρμογής κορυφών και t-test για στατιστική σημαντικότητα. Αναδείχθηκε αυξημένη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες στα καρκινικά δείγματα, ενώ οι φυσιολογικοί ιστοί εμφάνισαν υψηλότερο λόγο λιπιδίων/πρωτεϊνών και μεγαλύτερη συγκέντρωση κολλαγόνου. Στατιστικά σημαντικές διαφορές (p <0.001) εντοπίστηκαν σε χαρακτηριστικές κορυφές Raman στα 1004 cm-1 (φαινυλαλανίνη), 1341 cm-1 (Αμίδιο – ΙΙΙ, πρωτεϊνών), 1660 cm-1 (Αμίδιο–Ι, πρωτεϊνών), οι οποίες εμφάνισαν αύξηση της εντάσης στον καρκίνο, καθώς και στα 855 cm-1 (Κολλαγόνο), 1440 cm-1 (Πρωτεΐνες και Λιπίδια), 2852 cm-1 (Λιπίδια) για τις οποίες η ένταση ήταν αυξημένη στην περίπτωση των φυσιολογικών δειγμάτων. Η ανάλυση PCA επιβεβαίωσε τους βιοδείκτες, ενώ οι ίδιες μεταβολές παρατηρήθηκαν και στα in vivo πειράματα σε ποντίκια και στην προσομοίωση κλινικής εφαρμογής. Η ανάλυση μέσω προσαρμογής κορυφών στην ζώνη Raman του Αμιδίου–Ι έδειξε ότι στις πρωτεΐνες του καρκινικού ιστού επικρατεί η διαμόρφωση της α-έλικας σε αντίθεση με τον υγιή ιστό που επικρατεί η δευτεροταγής δομή β-πτυχωτής επιφάνειας. Συνολικά, η ανάλυση ανέδειξε ότι ο φυσιολογικός ιστός του παχέος εντέρου παρουσιάζει μεγαλύτερη φασματική ανομοιογένεια λόγω της σύνθετης δομής του και της υψηλότερη περιεκτικότητα σε λιπίδια και κολλαγόνο, ενώ τα καρκινικά δείγματα εμφανίζονται πιο ομοιογενή φασματικά. Για την εκτίμηση της διαγνωστικής ακρίβειας της μεθόδου εφαρμόστηκαν πολυπαραμετρικές στατιστικές μέθοδοι καθώς και τεχνικές μηχανικής μάθησης μέσω των μοντέλων ταξινόμησης PLS-DA και XGBoost. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων ταξινόμησης με μεθόδους μηχανικής μάθησης επέδειξαν ικανοποιητική διαγνωστική ακρίβεια στο πλαίσιο προ-κλινικής αξιολόγησης, ενισχύοντας την άποψη ότι η φασματοσκοπία Raman μπορεί να αξιοποιηθεί για την ανίχνευση καρκινικών ιστών στο παχύ έντερο. Για τα φάσματα micro-Raman από την κεντρική περιοχή των όγκων και από υγιείς περιοχές του εντέρου και λαμβάνοντας υπόψη τις διαφορετικές προσεγγίσεις εφαρμογής των αλγορίθμων, το μοντέλο PLS-DA παρουσίασε ακρίβεια 76-86%, ενώ αντίστοιχα, η εφαρμογή του πιο σύνθετου μοντέλου XGBoost οδήγησε σε ελαφρώς βελτιωμένες επιδόσεις, με ακρίβεια 78-86%. Τα αποτελέσματα ταξινόμησης καρκινικών και φυσιολογικών ιστών που ελήφθησαν με το Raman probe παρουσιάσαν αρκετά υψηλές τιμές των δεικτών απόδοσης. Ειδικότερα, για τα πειράματα προσομοίωσης κλινικής εφαρμογής σε ανθρώπινα δείγματα, η ακρίβεια κυμάνθηκε μεταξύ 94-97%, και για την in vivo μελέτη στο ζωικό μοντέλο ποντικιών η ακρίβεια έφτασε το 88-97%. Τα φάσματα των ορίων των όγκων εμφάνισαν κοινά χαρακτηριστικά τόσο με τους υγιείς όσο και με τους καρκινικούς ιστούς, αντανακλώντας την ετερογένεια της μεταβατικής περιοχής. Σημαντικές διαφορές εντοπίστηκαν σε ζώνες πρωτεϊνών (1004, 1658 cm⁻¹), κολλαγόνου (855, 918, 943 cm⁻¹) και λιπιδίων (1448, 2852 cm⁻¹), ενώ τα μοντέλα PLS-DA και XGBoost πέτυχαν ακρίβεια 82% στην αναγνώριση των ορίων. Η μελέτη των ιστών αορτικών βαλβίδων πραγματοποιήθηκε με φασματοσκοπία micro-Raman και χαρτογράφιση Raman (Raman mapping) σε λεπτά δείγματα πάχους 14-25 μm και στόχευε στον εντοπισμό και τον χαρακτηρισμό των επασβεστώσεων της CAVD. Στους ανθρώπινους παθολογικούς ιστούς παρατηρήθηκε η παρουσία ανόργανων αλάτων, όπως ανθρακικός υδροξυαπατίτης (ΗΑ) Β-τύπου (428, 961, 1071 cm⁻¹) αλλά και άμορφη κατανομή ανθρακικού ασβεστίου (1081 cm⁻¹). Η αποσυνέλιξη της ζώνης Raman στα 962 cm⁻¹ υπέδειξε ότι οι επασβεστώσεις συνίστανται κυρίως από καλά κρυσταλλωμένους κρυστάλλους ΗΑ, με ταυτόχρονη παρουσία μικρής ποσότητας πρόδρομων φάσεων, όπως το άμορφο φωσφορικό ασβέστιο (ACP). Η χαρτογράφηση Raman εντόπισε με ακρίβεια τα όρια όζου υδροξυαπατίτη στην επιφάνεια του ιστού, αναδεικνύοντας τη δυνατότητα της τεχνικής να αποτυπώνει με σαφήνεια μορφολογικά χαρακτηριστικά της προχωρημένης ασβεστοποίησης. Οι ιστοί με CAVD εμφάνισαν υπερέκφραση κολλαγόνου όπως φάνηκε από την ενίσχυση των αντίστοιχων χαρακτηριστικών κορυφών Raman (816, 855, 877, 921, 945 cm⁻¹), ενώ ο αυξημένος λόγος υδροξυπρολίνης/προλίνης (Hyp/Pro)—ιδίως στο δείγμα με έντονη ασβεστοποίηση—υποδηλώνει ενισχυμένη διασύνδεση κολλαγόνου που ενδέχεται να συσχετίζεται με την πρόοδο της ίνωσης και της παθολογικής ασβεστοποίησης. Οι μετρήσεις στο ζωικό μοντέλο κονίκλων επιβεβαίωσε τα παραπάνω ευρήματα αποκαλύπτοντας, ωστόσο, και επιπλέον χαρακτηριστικά, όπως την συνύπαρξη υδροξυαπατίτη με πυροφωσφορικό ασβέστιο (960 και 1040 cm⁻¹, αντίστοιχα) καθώς και άλλες πρόδρομες φάσεις φωσφορικών (β-TCP, ACP και OCP) στα προχωρημένα στάδια (δείγματα 7 εβδομάδων), καθώς και την πιθανή παρουσία ανθρακικού ασβεστίου (1070 cm⁻¹ και ~1080 cm⁻¹) στα πρώιμα στάδια (δείγματα 2 εβδομάδων). Επιπλέον μετρήσεις σε δείγματα ιζημάτων, που προέκυψαν από φυγοκέντρηση των ομογενοποιημένων βαλβιδικών ιστών από κονίκλους, αποκάλυψαν την παρουσία μικρής ποσότητας υδροξυαπατίτη ή φωσφορικών αλάτων ήδη από τα πρώιμα στάδια, με σταδιακή αύξηση του υδροξυαπατίτη κατά την εξέλιξη της νόσου (0 → 2 → 4 → 7 εβδομάδες). Τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι η φασματοσκοπία Raman μπορεί να αποτυπώσει με αξιοπιστία σημαντικό μέρος των βιοχημικών μεταβολών σε CRC και CAVD, αναδεικνύοντας χαρακτηριστικούς φασματικούς δείκτες και σημαντική διαγνωστική δυνατότητα. Τα ευρήματα ενισχύουν τις προοπτικές της τεχνικής για μελλοντικές κλινικές εφαρμογές.