Investigation into the cell biological roles of class II PI3K-C2β

Abstract

This PhD thesis provides a detailed investigation into the biological roles and molecular mechanisms of action of the class II phosphoinositide 3-kinase (PI3K) isoform PI3K-C2β, a member of a broader lipid kinase family that generates key phosphoinositide second messengers - PI3P, PI(3,4)P2, and PI(3,4,5)P3. These lipids are central regulators of intracellular signalling and membrane trafficking, controlling the localization and activity of numerous downstream effectors involved in processes such as cell proliferation, survival, metabolism, and transport.Although class I PI3Ks have been extensively studied - particularly due to their frequent mutation in cancer - the physiological roles of class II and III PI3Ks remain comparatively underexplored. Class II PI3Ks, including PI3K-C2β, are known to produce PI3P and PI(3,4)P2 on intracellular membranes and have emerged as important regulators of vesicular trafficking. However, their in vivo functions and precise mechanisms of action are still incompletely understood. To address this gap, the thesis focuses on elucidating the specific biological functions of PI3K-C2β. Two complementary experimental strategies were employed: (1) siRNA-mediated depletion of PI3K-C2β in HeLa cells, and (2) the use of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) derived from a kinase-dead knock-in (KI) mouse model of PI3K-C2β. This genetic model enables the dissection of kinase-dependent functions without altering protein expression levels or interfering with potential scaffold roles of the protein, thereby providing a more precise understanding of its catalytic activity. The study identifies a critical role for PI3K-C2β in the regulation of focal adhesion (FA) dynamics and cell migration. Cell migration is a complex, multi-step process requiring tightly coordinated cycles of focal adhesion assembly, maturation, and disassembly, alongside actin cytoskeleton remodelling. The results demonstrate that depletion or inactivation of PI3K-C2β leads to a marked increase in the number of focal adhesions, delayed focal adhesion disassembly, and consequently impaired cell migration. These findings establish PI3K-C2β as a positive regulator of focal adhesion turnover. Further mechanistic insights are provided through live-cell imaging and biochemical approaches. PI3K-C2β is shown to localize specifically to disassembling focal adhesions, particularly following treatment with blebbistatin, a pharmacological agent used to induce focal adhesion disassembly. Additionally, a yeast two-hybrid screen identified DEPDC1B - a known promoter of focal adhesion disassembly - as a novel interacting partner of PI3K-C2β, an interaction subsequently validated by immunoprecipitation assays. Evidence is also presented for an interaction between PI3K-C2β and talin, a key structural component of focal adhesions. Together, these findings suggest that PI3K-C2β may regulate focal adhesion dynamics through coordinated interactions with proteins involved in adhesion turnover, although the precise molecular interplay between PI3K-C2β, DEPDC1B, and talin requires further investigation. Beyond its role in focal adhesion regulation, PI3K-C2β has previously been implicated in additional cellular processes, including attenuation of mTORC1 signalling and regulation of lysosomal positioning. However, prior to this study, the mechanistic basis for its involvement in cell migration remained unclear. This thesis addresses this gap by linking PI3K-C2β activity directly to focal adhesion disassembly, thereby providing the first clear mechanistic explanation of how this enzyme influences cell motility. The impact of this work is significant, as it advances the understanding of class II PI3Ks and their contributions to fundamental cellular processes. By identifying PI3K-C2β as a key regulator of focal adhesion dynamics, the study opens new avenues for exploring its potential roles in physiological and pathological contexts where cell migration is critical, such as development, wound healing, and cancer metastasis. In addition to its scientific contributions, the project fostered international collaboration between leading research groups in the PI3K field, including laboratories at University College London and the Leibniz Institute for Molecular Pharmacology in Berlin. This collaboration facilitated the exchange of expertise and resources, strengthening research efforts in phosphoinositide biology. The work was supported by the European Union’s Horizon 2020 Marie Skłodowska-Curie PhD training programme, which also enabled the development of a broad, interdisciplinary network of scientists and promoted future research and communication opportunities within the field.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνά σε βάθος τους βιολογικούς ρόλους και τους μοριακούς μηχανισμούς δράσης της ισομορφής PI3K-C2β, μέλους της οικογένειας των φωσφοϊνοσιτιδικών 3-κινασών (PI3Ks). Οι PI3Ks αποτελούν λιπιδικές κινάσες που παράγουν τα δευτερογενή σηματοδοτικά μόρια PI3P, PI(3,4)P2 και PI(3,4,5)P3, τα οποία λειτουργούν ως κεντρικοί ρυθμιστές της ενδοκυττάριας σηματοδότησης και της διακίνησης μεμβρανών. Μέσω αυτών, ρυθμίζουν την εντόπιση και τη δραστικότητα πολυάριθμων κατάντη εκτελεστικών μορίων που εμπλέκονται σε διεργασίες όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η επιβίωση, ο μεταβολισμός και η ενδοκυττάρια μεταφορά. Παρότι οι PI3Ks κατηγορίας I έχουν μελετηθεί εκτενώς, κυρίως λόγω της εμπλοκής τους στον καρκίνο, οι ισομορφές των κατηγοριών II και III παραμένουν λιγότερο κατανοητές. Οι PI3Ks κατηγορίας II, όπως η PI3K-C2β, παράγουν PI3P και PI(3,4)P2 σε ενδοκυττάριες μεμβράνες και έχουν αναδειχθεί ως σημαντικοί ρυθμιστές της ενδοκυττάριας κυστιδιακής κυκλοφορίας. Ωστόσο, οι λειτουργίες τους in vivo και οι ακριβείς μηχανισμοί δράσης τους δεν έχουν ακόμη πλήρως διευκρινιστεί. Με στόχο την κάλυψη αυτού του κενού γνώσης, η παρούσα διατριβή επικεντρώνεται στην αποσαφήνιση των επιμέρους βιολογικών λειτουργιών της PI3K-C2β και των μηχανισμών μέσω των οποίων δρα. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν δύο συμπληρωματικές πειραματικές προσεγγίσεις: (1) αποσιώπηση της PI3K-C2β με τη χρήση siRNA σε κύτταρα HeLa και (2) μελέτη ινοβλαστών εμβρύου ποντικού (MEFs) που προέρχονται από γενετικά τροποποιημένο μοντέλο knock-in με καταλυτικά ανενεργή (kinase-dead) μορφή της PI3K-C2β. Το γενετικό αυτό μοντέλο επιτρέπει τη διάκριση των λειτουργιών που εξαρτώνται από την καταλυτική δράση της κινάσης, χωρίς να επηρεάζεται η έκφραση της πρωτεΐνης ή πιθανές δομικές (scaffold) λειτουργίες της, παρέχοντας έτσι μια πιο ακριβή κατανόηση της ενζυμικής της δραστικότητας. Τα αποτελέσματα της μελέτης αναδεικνύουν έναν κρίσιμο ρόλο της PI3K-C2β στη ρύθμιση της δυναμικής των εστιακών προσκολλήσεων (focal adhesions, FAs) και της κυτταρικής μετανάστευσης. Η κυτταρική μετανάστευση αποτελεί μια σύνθετη, πολυβηματική διαδικασία που απαιτεί στενά συντονισμένους κύκλους συναρμολόγησης, ωρίμανσης και αποσυναρμολόγησης των εστιακών προσκολλήσεων, σε συνδυασμό με την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού ακτίνης. Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η αποσιώπηση ή η απενεργοποίηση της PI3K-C2β οδηγεί σε σημαντική αύξηση του αριθμού των εστιακών προσκολλήσεων, καθυστέρηση στην αποσυναρμολόγησή τους και, κατά συνέπεια, σε μειωμένη κυτταρική μετανάστευση. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν ότι η PI3K-C2β λειτουργεί ως θετικός ρυθμιστής της ανακύκλωσης των εστιακών προσκολλήσεων. Περαιτέρω μηχανιστικές ενδείξεις προκύπτουν από απεικόνιση ζωντανών κυττάρων και βιοχημικές προσεγγίσεις. Η PI3K-C2β εντοπίζεται ειδικά σε εστιακές προσκολλήσεις που βρίσκονται σε φάση αποσυναρμολόγησης, ιδιαίτερα κατόπιν έκθεσης σε blebbistatin, έναν φαρμακολογικό παράγοντα που επάγει την αποδόμηση των δομών αυτών. Επιπλέον, με τη χρήση ανάλυσης δύο υβριδίων σε ζυμομύκητες (yeast two-hybrid, Y2H), ταυτοποιήθηκε η πρωτεΐνη DEPDC1B, ένας γνωστός προαγωγέας της αποσυναρμολόγησης των εστιακών προσκολλήσεων, ως νέος αλληλεπιδρών συνεργάτης της PI3K-C2β, αλληλεπίδραση η οποία επιβεβαιώθηκε με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης. Παράλληλα, παρουσιάζονται ενδείξεις αλληλεπίδρασης της PI3K-C2β με την ταλίνη (talin), βασικό δομικό συστατικό των εστιακών προσκολλήσεων. Συνολικά, τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν ότι η PI3K-C2β ενδέχεται να ρυθμίζει τη δυναμική των εστιακών προσκολλήσεων μέσω συντονισμένων αλληλεπιδράσεων με πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην ανακύκλωση των προσκολλήσεων, αν και η ακριβής μοριακή συνεργασία μεταξύ PI3K-C2β, DEPDC1B και ταλίνης απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Πέρα από τον ρόλο της στη ρύθμιση των εστιακών προσκολλήσεων, η PI3K-C2β έχει επίσης συνδεθεί με άλλες κυτταρικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της αναστολής της σηματοδότησης mTORC1 και της ρύθμισης της χωροθέτησης των λυσοσωμάτων. Ωστόσο, πριν από την παρούσα μελέτη, η μηχανιστική βάση της συμμετοχής της στην κυτταρική μετανάστευση παρέμενε ασαφής. Η παρούσα διατριβή καλύπτει αυτό το κενό γνώσης, συνδέοντας άμεσα τη δραστικότητα της PI3K-C2β με την αποσυναρμολόγηση των εστιακών προσκολλήσεων, παρέχοντας έτσι την πρώτη σαφή μηχανιστική εξήγηση για τον τρόπο με τον οποίο το ένζυμο αυτό επηρεάζει την κυτταρική κινητικότητα. Η συμβολή της παρούσας εργασίας είναι σημαντική, καθώς προάγει την κατανόηση των PI3Ks κατηγορίας II και της συμμετοχής τους σε θεμελιώδεις κυτταρικές διεργασίες. Με την ανάδειξη της PI3K-C2β ως βασικού ρυθμιστή της δυναμικής των εστιακών προσκολλήσεων, η μελέτη αυτή ανοίγει νέες προοπτικές για τη διερεύνηση πιθανών ρόλων της σε φυσιολογικά και παθολογικά πλαίσια όπου η κυτταρική μετανάστευση είναι κρίσιμη, όπως η ανάπτυξη, η επούλωση τραυμάτων και η μετάσταση καρκινικών κυττάρων. Τέλος, η διατριβή αυτή συνέβαλε και στην ενίσχυση διεθνούς συνεργασίας μεταξύ κορυφαίων ερευνητικών ομάδων στον τομέα των PI3Ks, συμπεριλαμβανομένων εργαστηρίων στο University College London και στο Leibniz Institute for Molecular Pharmacology στο Βερολίνο, προωθώντας την ανταλλαγή τεχνογνωσίας και πόρων και ενισχύοντας τις ερευνητικές προσπάθειες στον τομέα της βιολογίας των φωσφοϊνοσιτιδίων. Το έργο υποστηρίχθηκε από το πρόγραμμα διδακτορικής εκπαίδευσης Marie Skłodowska-Curie του προγράμματος Horizon 2020 της Ευρωπαϊκής Ένωσης, το οποίο συνέβαλε επίσης στη δημιουργία ενός ευρέος διεπιστημονικού δικτύου επιστημόνων και ενίσχυσε τις προοπτικές μελλοντικής επιστημονικής συνεργασίας και καινοτομίας.