Single molecule MATAC-seq reveals key determinants for DNA replication efficiency

Abstract

The stochastic nature of origin activation results in significant variability in the way genome replication is carried out from cell to cell. The reason for the diversity in efficiency and timing of individual origins has remained an unresolved issue for a long time. Cell-to-cell variability has been demonstrated to play a crucial role in cellular plasticity and cancer in mammalian cells. Although population-based methods have provided valuable insight into biological processes, it is necessary to use single molecule techniques to uncover events that are hidden by the population average. Many biological processes, such as DNA replication, transcription, and gene expression, are closely linked to the local chromatin structure. In yeast, although DNA replication origins have conserved DNA sequences, they display remarkable differences in timing and efficiency. Some origins initiate replication earlier during S-phase or more frequently than others, resulting in a high degree of heterogeneity among the cells in a population, with no two cells having the exact same replication profile. Our hypothesis is that the local nucleosomal structure may affect the DNA replication profile of individual origins. To explore this relationship, we have developed Methylation Accessibility of Targeted Chromatin domain Sequencing (MATAC-Seq) to determine single-molecule chromatin accessibility maps of specific genomic locations after targeted purification in their native chromatin context. Our analysis of selected early-efficient (EE) and late-inefficient (LI) replication origins in Saccharomyces cerevisiae using MATAC-Seq revealed significant cell-to-cell heterogeneity in their chromatin states. Disrupting the INO80 or ISW2 chromatin remodeling complexes led to changes at individual nucleosomal positions that correspond to changes in replication efficiency. Our results show that a chromatin state with a narrow size of accessible origin DNA in combination with well-positioned surrounding nucleosomes and an open +2 linker region was a strong predictor for efficient origin activation. MATAC-Seq provides a single-molecule assay for chromatin accessibility that reveals the large spectrum of alternative chromatin states that coexist at a given locus, which was previously masked in population-based experiments. This provides a mechanistic basis for origin activation heterogeneity that occurs during DNA replication in eukaryotic cells. As a result, our single-molecule assay for chromatin accessibility will be ideal for defining single-molecule heterogeneity across many biological processes, such as transcription, replication, or DNA repair in vitro and ex vivo.

Η στοχαστική φύση της ενεργοποίησης των σημείων έναρξης της αντιγραφής (origins) οδηγεί σε σημαντική μεταβλητότητα στον τρόπο με τον οποίο πραγματοποιείται η αντιγραφή του γονιδιώματος από κύτταρο σε κύτταρο. Η αιτία αυτής της ποικιλομορφίας ως προς την αποδοτικότητα και τον χρονισμό των επιμέρους origins παρέμενε για μεγάλο χρονικό διάστημα άλυτο ζήτημα. Η μεταβλητότητα μεταξύ κυττάρων έχει αποδειχθεί ότι διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην κυτταρική πλαστικότητα και στον καρκίνο στα θηλαστικά κύτταρα. Παρότι οι μέθοδοι που βασίζονται σε πληθυσμιακές μετρήσεις έχουν προσφέρει πολύτιμες γνώσεις για βιολογικές διεργασίες, η χρήση τεχνικών σε επίπεδο μεμονωμένου μορίου είναι απαραίτητη για την αποκάλυψη γεγονότων που αποκρύπτονται από τον μέσο όρο του πληθυσμού. Πολλές βιολογικές διεργασίες, όπως η αντιγραφή του DNA, η μεταγραφή και η γονιδιακή έκφραση, συνδέονται στενά με τη τοπική δομή της χρωματίνης. Στη ζύμη, αν και τα σημεία έναρξης της αντιγραφής του DNA διαθέτουν συντηρημένες αλληλουχίες DNA, παρουσιάζουν εντυπωσιακές διαφορές ως προς τον χρονισμό και την αποδοτικότητά τους. Ορισμένα origins εκκινούν την αντιγραφή νωρίτερα κατά τη φάση S ή ενεργοποιούνται συχνότερα από άλλα, με αποτέλεσμα έναν υψηλό βαθμό ετερογένειας μεταξύ των κυττάρων ενός πληθυσμού, χωρίς δύο κύτταρα να εμφανίζουν ακριβώς το ίδιο προφίλ αντιγραφής. Η υπόθεσή μας είναι ότι η τοπική νουκλεοσωμική δομή μπορεί να επηρεάζει το προφίλ αντιγραφής του DNA των επιμέρους origins. Για τη διερεύνηση αυτής της σχέσης, αναπτύξαμε τη μέθοδο Methylation Accessibility of Targeted Chromatin domain Sequencing (MATAC-Seq), η οποία επιτρέπει τον προσδιορισμό χαρτών προσβασιμότητας της χρωματίνης σε επίπεδο μεμονωμένου μορίου σε συγκεκριμένες γονιδιωματικές θέσεις, μετά από στοχευμένο καθαρισμό τους στο φυσικό τους χρωματινικό περιβάλλον. Η ανάλυση επιλεγμένων πρώιμων-αποδοτικών (early-efficient, EE) και όψιμων-μη αποδοτικών (late-inefficient, LI) origins αντιγραφής στο Saccharomyces cerevisiae με τη χρήση της MATAC-Seq αποκάλυψε σημαντική ετερογένεια μεταξύ κυττάρων ως προς τις καταστάσεις της χρωματίνης τους. Η διαταραχή των συμπλόκων αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης INO80 ή ISW2 οδήγησε σε μεταβολές σε μεμονωμένες νουκλεοσωμικές θέσεις, οι οποίες συσχετίζονταν με αλλαγές στην αποδοτικότητα της αντιγραφής. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μια χρωματινική κατάσταση που χαρακτηρίζεται από στενό εύρος προσβάσιμου DNA στο origin, σε συνδυασμό με καλά τοποθετημένα περιβάλλοντα νουκλεοσώματα και μια ανοικτή περιοχή συνδέτη +2, αποτελεί ισχυρό προγνωστικό δείκτη για την αποδοτική ενεργοποίηση των origins. Η MATAC-Seq παρέχει μια δοκιμασία προσβασιμότητας της χρωματίνης σε επίπεδο μεμονωμένου μορίου, η οποία αποκαλύπτει το ευρύ φάσμα εναλλακτικών χρωματινικών καταστάσεων που συνυπάρχουν σε έναν δεδομένο γενετικό τόπο και οι οποίες ήταν προηγουμένως αθέατες σε πειράματα βασισμένα σε πληθυσμιακές αναλύσεις. Αυτό προσφέρει μια μηχανιστική βάση για την ετερογένεια της ενεργοποίησης των origins που παρατηρείται κατά την αντιγραφή του DNA σε ευκαρυωτικά κύτταρα. Ως εκ τούτου, η δοκιμασία μας προσβασιμότητας της χρωματίνης σε επίπεδο μεμονωμένου μορίου είναι ιδανική για τον προσδιορισμό της ετερογένειας σε επίπεδο μεμονωμένου μορίου σε πλήθος βιολογικών διεργασιών, όπως η μεταγραφή, η αντιγραφή ή η επιδιόρθωση του DNA, τόσο in vitro όσο και ex vivo.