Μελέτη μηχανισμών αντίστασης του anti-PD-1 σε ασθενείς με μεταστατικό μελάνωμα

Abstract

Immune checkpoint inhibitors (ICIs) have significantly improved outcomes in melanoma by enhancing adaptive immunity, but not all patients benefit equally. While some experience early relapses, others maintain long-term responses, even after stopping treatment. To uncover cellular and molecular markers in the blood that may distinguish advanced (stage III) from metastatic (stage IV) melanoma and predict immune escape mechanisms, we analyzed 100 consecutive patients diagnosed with stage III/IV melanoma who were about to begin ICI therapy. Before initiating treatment, all patients underwent multiparameter flow cytometry and immune cell isolation using standard conjugated antibodies. Based on recurrence-free or progression-free survival (RFS/PFS), we retrospectively selected patients with the most distinct clinical outcomes. Specifically, we focused on two subgroups — seven strong responders and seven non-responders — and conducted bulk RNA sequencing (RNA-seq) of their circulating CD4+ T cells. We used differential expression analysis (DEA) and Gene Ontology (GO) enrichment to identify gene expression differences and related pathways, comparing stage III vs. IV disease and long-term vs. early non-responders.Although the overall number of circulating immune cells was similar across groups, transcriptomic analyses revealed distinct gene expression profiles. There were 189 vs. 92 differentially expressed genes (DEGs) in stage IV vs. III patients, and 101 vs. 47 DEGs in early progressors vs. long-term responders. These genes were associated with specific biological pathways. In metastatic cases (stage IV), upregulated pathways included: Inflammatory response (e.g., ADGRE5/2, CYBA, GRN, HMOX1, IRF5, ITGAM); Adaptive immunity (e.g., CD1C, CD74,CYBB, NCF2, S100A8/9, BCL3); T-cell activation (e.g., BCL3, CD1C, CD74, FCER1G, FGL2) and Lipid metabolism and catabolism (e.g., ARF3, GPX1, CTSA, PNPLA2, ABHD4). In early ICI non-responders, key upregulated pathways included: Immune effector processing (e.g., HLA-DQA1/DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1/DRB5, NKG7, TYROBP); PD-1 signaling (e.g., HLA-DQA1/DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1/DRB5); Interferon signaling (e.g., HLA-DQA1/DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1/DRB5, NCAM1, IFITM3); Positive regulation of T-cell activation (e.g., BCL6, HLA-DQA1/DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1/DRB5, HAVCR2), and CD28 co-stimulation (e.g., HLA-DQA1/DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1/DRB5), all indicative of immune dysregulation or exhaustion. Our findings suggest that specific gene expression patterns and immune-related pathways in peripheral CD4+ T cells can help predict melanoma stage and resistance to immunotherapy.

Η ενίσχυση της προσαρμοστικής ανοσίας με αναστολείς σημείων ελέγχου (ICIs) έχει βελτιώσει ριζικά την πρόγνωση του μελανώματος, όχι όμως για όλους τους ασθενείς. Ορισμένες περιπτώσεις υποτροπιάζουν μέσα στους πρώτους μήνες, ενώ άλλες διατηρούν μακροχρόνιο όφελος, ακόμα και μετά τη διακοπή της ανοσοθεραπείας. Για την αναγνώριση κυτταρικών/μοριακών υπογραφών στο περιφερικό αίμα που θα μπορούσαν να διαφοροποιούν το προχωρημένο (στάδιο III) από το μεταστατικό (στάδιο IV) μελάνωμα και να προβλέπουν τη δυναμική της πρωτογενούς/δευτερογενούς ανοσολογικής διαφυγής, μελετήσαμε 100 διαδοχικούς ασθενείς με μελάνωμα σταδίου III/IV που επρόκειτο να ξεκινήσουν θεραπεία με ICIs. Κατά τη διάγνωση του μελανώματος, πραγματοποιήθηκε πολυπαραμετρική κυτταρομετρική ανάλυση ροής και διαδικασία καθαρισμού με χρήση τυπικών συζευγμένων αντισωμάτων για όλους τους ασθενείς, πριν την έναρξη της ανοσοθεραπείας. Σε κάθε στάδιο (III/IV), σύμφωνα με την ελεύθερη υποτροπής/πρόοδου επιβίωση (RFS/PFS), επιλέχθηκαν αναδρομικά οι περιπτώσεις με την πιο ξεκάθαρη κλινική έκβαση και εστιάσαμε την ανάλυσή μας στους ακραίους ανταποκριτές (n=7) και μη ανταποκριτές (n=7). Στόχος ήταν η χαρακτηριστική ανάλυση των μεταγραφωμάτων των περιφερικών CD4+ T-λεμφοκυττάρων με χρήση μαζικής RNA αλληλούχισης (bulk RNA-seq), ανάλυση διαφορικής έκφρασης γονιδίων (DEA) και ανάλυση εμπλουτισμού γονιδιακής έκφρασης (οντολογία γονιδίων, GO). Με βάση αυτή την επιλεγμένη ομάδα ασθενών, διερευνήσαμε γονίδια με διαφορική έκφραση (DEGs) και βασικές μοριακές οδούς που φαίνεται να ενεργοποιούνται κατά προτίμηση στο στάδιο III έναντι του IV μελανώματος, καθώς και σε ασθενείς με μακροχρόνια απόκριση έναντι πρώιμης εξέλιξης στην ανοσοθεραπεία. Αν και τα περιφερικά ανοσοκύτταρα δεν εμφάνισαν αριθμητικές διαφορές στις δύο αναλύσεις (στάδιο και απόκριση στους ICIs), τα δεδομένα από τις αναλύσεις DEA και GO έδειξαν ότι οι ασθενείς μπορούσαν να ομαδοποιηθούν διακριτά, προσδιορίζοντας 189 έναντι 92 DEGs στο στάδιο IV έναντι III, και 101 έναντι 47 DEGs στους πρώιμους εξελισσόμενους ασθενείς έναντι των μακροχρόνιων ανταποκριτών. Αυτά τα γονίδια με διαφορική έκφραση σχετίζονται λειτουργικά με διαφορετικές μοριακές οδούς. Για τις μεταστατικές περιπτώσεις: φλεγμονώδης απόκριση (π.χ. ADGRE5/2, CYBA, GRN, HMOX1, IRF5, ITGAM); προσαρμοστική ανοσία (π.χ. CD1C, CD74, CYBB, NCF2, CTSA, S100A8/9, BCL3); ενεργοποίηση Τ-κυττάρων (π.χ. BCL3, CD1C, CD74, FCER1G, FGL2); Και μεταβολισμός/Καταβολισμός λιπιδίων (π.χ. ARF3, GPX1, CTSA, PNPLA2, ABHD4). Ενώ για ασθενείς με πρώιμη εξέλιξη στους ICIs: επεξεργασία ανοσολογικών αποτελεσμάτων (HLA-DQA1/DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1/DRB5, NKG7, TYROBP); οδός PD-1 (π.χ. HLA-DQA1/DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1/DRB5); σηματοδότηση ιντερφερόνης (IFN) (π.χ. HLA-DQA1/DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1/DRB5, NCAM1, IFITM3), θετική ρύθμιση ενεργοποίησης Τ-κυττάρων (π.χ. BCL6, HLA-DQA1/DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1/DRB5, HAVCR2), συνεργατική διέγερση μέσω CD28 (π.χ. HLA-DQA1/DQB1, HLA-DRA, HLA-DRB1/DRB5). Όλες οι παραπάνω μοριακές υπογραφές υποστηρίζουν μία ανοσορυθμιζόμενη βιολογική συμπεριφορά. Συγκεκριμένες βιολογικές οδοί και γονίδια-δείκτες στα περιφερικά CD4+ Τ-λεμφοκύτταρα μπορεί να προδιαγράφουν το στάδιο του μελανώματος και την αντίσταση στην ανοσοθεραπεία.