Επίδραση των μεσεγχυματικών πολυδύναμων κυττάρων και της βινποσετίνης σε in vitro μοντέλο ηλικιακής εκφύλισης της ωχράς κηλίδας

Abstract

Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of vision loss in the developed world, with no effective treatment available to date. The aim of the present study is to evaluate the effects of bone marrow stem cells (BMSCs), vinpocetine and their combination in an amyloid-β (Aβ)-induced in vitro model of AMD. Materials and Methods: Human retinal pigment epithelial cells (ARPE-19) were utilized and exposed to 10 μM Aβ1–42 for 24 hours. Cells were allocated into the following groups: (i) BMSC co-culture, (ii) vinpocetine treatment, (iii) combined BMSCs and vinpocetine treatment, (iv) Aβ1–42 exposure alone, and (v) control group. Cell viability was assessed using the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) and MTT assays. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was performed to determine mRNA expression levels of genes associated with angiogenesis—vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) and pigment epithelium-derived factor (PEDF)—and with the visual cycle, including: lecithin–retinol acyltransferase (LRAT), retinoid isomerohydrolase (RPE65), retinol dehydrogenase 5 (RDH5), retinol dehydrogenase 10 (RDH10), and retinaldehyde-binding protein 1 (RLBP1). Furthermore, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was employed to quantify protein levels of the inflammatory cytokines interleukin (IL)-6 and IL-8, as well as MerTK expression, reflecting the phagocytic function of the retinal pigment epithelium (RPE). Results: Exposure to 10 μM Aβ1–42 resulted in a significant reduction in ARPE-19 cell viability (p = 0.02), whereas all proposed interventions significantly restored viability to near-control levels. Aβ1–42 exposure induced an increase in VEGF-A expression, which was significantly reduced in all intervention groups. Concurrently, Aβ1–42 caused a mild increase in PEDF expression; however, a significant upregulation was observed in the intervention groups, with the combined BMSC and vinpocetine treatment demonstrating the strongest effect (p = 0.02). Furthermore, Aβ1–42 exposure led to increased expression of most visual cycle–related genes, which was restored by the interventions. In addition, Aβ1–42 significantly elevated protein levels of the inflammatory cytokines IL-6 and IL-8, whereas their levels were significantly reduced in all treatment groups. MerTK levels were significantly increased in response to Aβ1–42 exposure, possibly reflecting a compensatory clearance mechanism of the retinal pigment epithelium. Conclusions: In summary, the present study demonstrates that Aβ1–42 plays a pivotal role in inducing cytotoxicity, promoting angiogenesis, activating inflammatory responses, and disrupting the expression of visual cycle–related genes in RPE. These alterations represent key pathogenic mechanisms contributing to the progression of AMD. Intervention with BMSCs, vinpocetine, and their combination, significantly reversed these effects and contributed to the restoration of epithelial structural and functional integrity. These findings highlight the potential therapeutic value of the proposed approaches in AMD. Further investigation in other preclinical and clinical models is warranted.

Η Ηλικιακή Εκφύλιση της Ωχράς Κηλίδας (Η.Ε.Ω.) αποτελεί την κυριότερη αιτία απώλειας της όρασης στον ανεπτυγμένο κόσμο χωρίς αποτελεσματική θεραπεία μέχρι στιγμής. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η αξιολόγηση της επίδρασης των βλαστοκυττάρων του μυελού των οστών (Bone Marrow Stem Cells, BMSCs), της βινποσετίνης ή του συνδυασμού σε επαγόμενο από το αμυλοειδές-β (Αβ) μοντέλο της Η.Ε.Ω. Υλικά και Μέθοδοι: Χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινα κύτταρα μελαγχρόου επιθηλίου του αμφιβληστροειδούς, τα ARPE-19, τα οποία εκτέθηκαν σε 10 μΜ Aβ1–42 για 24 ώρες και κατανεμήθηκαν στις εξής ομάδες: (i) συγκαλλιέργεια BMSCs, (ii) έκθεση σε βινποσετίνη, (iii) έκθεση σε συνδυασμό BMSCs και βινποσετίνη, (iv) έκθεση στο Αβ 1-42 μόνο και (v) ομάδα ελέγχου. Η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε με τη χρήση της δοκιμασίας Cell Counting Kit-8 (CCK-8) και ΜΤΤ. Η ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR) χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης mRNA γονιδίων που σχετίζονται με την αγγειογένεση: του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα τύπου Α (VEGF-A) και του παράγοντα που προέρχεται από το μελάγχρουν επιθήλιο (PEDF), και με τον κύκλο της όρασης: λεκιθίνη-ρετινόλη ακυλοτρανσφεράση (LRAT), ρετινοειδής ισομεροϋδρολάση (RPE65), ρετινόλη αφυδρογονάση 5 (RDH5), ρετινόλη αφυδρογονάση 10 (RDH10) και πρωτεΐνη δέσμευσης ρετιναλδεΰδης 1 (RLPB1). Ταυτόχρονα, με την μέθοδο της ενζυμικής ανοσομέτρησης (ELISA) προσδιορίστηκαν τα επίπεδα των φλεγμονωδών κυτταροκινών ιντερλευκίνης (IL)-6 και -8 και τα επίπεδα πρωτεϊνικής έκφρασης της MerTΚ που αντανακλά τη φαγοκυτταρική λειτουργία του μελαγχρόου επιθηλίου. Αποτελέσματα: Η έκθεση σε 10μΜ Aβ1–42 οδήγησε σε σημαντική μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων του ARPE-19 (p=0.02), ενώ όλες οι προτεινόμενες παρεμβάσεις αποκατέστησαν σημαντικά τη βιωσιμότητα σχεδόν στα επίπεδα της ομάδας ελέγχου (p<0.05). Η έκθεση στο Aβ1–42 προκάλεσε αύξηση της έκφρασης του VEGF-A, η οποία μειώθηκε σημαντικά σε όλες τις ομάδες παρέμβασης. Παράλληλα, το Aβ1–42 προκάλεσε ήπια αύξηση της έκφρασης του PEDF, ενώ στις ομάδες παρέμβασης παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση του, με τη συνεργική δράση των BMSCs και της βινποσετίνης να παρουσιάζει το ισχυρότερο αποτέλεσμα (p=0.02). Επιπλέον, το Aβ1–42 προκάλεσε αύξηση στην έκφραση των περισσότερων γονιδίων του κύκλου της όρασης, η οποία ρυθμίστηκε από τις προτεινόμενες παρεμβάσεις. Ταυτόχρονα, η έκθεση στο Aβ1–42 προκάλεσε αύξηση των πρωτεϊνικών επιπέδων των φλεγμονωδών κυτταροκινών IL-6 και IL-8 ενώ τα επίπεδα τους μειώθηκαν σημαντικά από σε όλες τις ομάδες παρέμβασης. Τα επίπεδα της MerTK, αυξήθηκαν σημαντικά σε απάντηση στην έκθεση στο Αβ1-42 πιθανόν ως αντιρροπιστικός μηχανισμός κάθαρσης του μελαγχρόου επιθηλίου. Συμπεράσματα: Συνοψίζοντας, η παρούσα μελέτη τεκμηριώνει ότι το Aβ1–42 διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην πρόκληση κυτταροτοξικότητας, στην ενίσχυση της αγγειογένεσης, στην ενεργοποίηση της φλεγμονώδους απάντησης και στη διαταραχή της έκφρασης γονιδίων του κύκλου της όρασης στα κύτταρα του μελαγχρόου επιθηλίου του αμφιβληστροειδούς. Οι εν λόγω μεταβολές συνιστούν σημαντικούς παθογενετικούς μηχανισμούς που συμβάλλουν στην έναρξη και εξέλιξη της Η.Ε.Ω. Η παρέμβαση με BMSCs, βινποσετίνη, καθώς και ο συνδυασμός τους, επέφερε σημαντική αναστροφή των ανωτέρω επιδράσεων και οδήγησε στην αποκατάσταση της δομικής και λειτουργικής ακεραιότητας του επιθηλίου. Τα ευρήματα αυτά αναδεικνύουν το πιθανό θεραπευτικό δυναμικό των προτεινόμενων προσεγγίσεων στην Η.Ε.Ω. Η περαιτέρω τεκμηρίωση των αποτελεσμάτων και σε άλλα προκλινικά και κλινικά μοντέλα είναι αναγκαία.