Λειτουργικές αλληλεπιδράσεις της χρωματίνης με τα σηματοδοτικά μονοπάτια της ανάπτυξης στα φυτά

Abstract

HEAT SHOCK PROTEIN 90 is a family of molecular chaperones highly conserved between eukaryotes. They comprise an integral part of cell proteostasis. They have been shown to play central roles in processes such as cellular homeostasis, organismal development and evolution. They show substrate selectivity and act mostly after protein synthesis, helping to maintain their substrates mostly in a functional state, in cooperation with helper proteins termed co-chaperones. Even though they have been traditionally characterized as cytoplasmic proteins, they also play important roles in the nucleus of metazoan cells. Two such examples are the transcriptional regulation of many environmentally induced genes and the control of chromatin conformation. In the model plant Arabidopsis. thaliana, the family contains seven members, four of which are cytoplasmic, while the other three are organellar. They have been shown to control several developmental processes throughout the life cycle of the plant, by regulating the functionality or stability of key molecules such as receptors, kinases or transcription factors involved in signal transduction pathways. One pathway where they participate in multiple levels is that of the plant hormones brassinosteroids (BR) and jasmonic acid (JA), while their role in the auxin pathway has recently begun to be investigated. On the contrary, nothing is known for HSP90 involvement in the signal transduction pathway of gibberellins (GA), another plant hormone that works in synergy with BR. GAs are plant hormones that promote the flowering transition and inhibit floral meristem formation. Through a combination of genetic analyses, microscopic, biochemical and molecular biology methods it was shown that HSP90.1 and HSP90.3 interact with two members of the DELLA family of proteins (RGA and GAI), central inhibitors of the GA pathway. Further analysis showed that lack of HSP90 activity, either due to inhibition or due to lower protein levels, leads to deregulated expression of GA biosynthetic enzymes and stabilization of RGA in cells with elongation potential. These results support the involvement of HSP90 in the GA signal transduction pathway and reveal an additional aspect of HSP90 in their function as integrators of developmental signals. After germination, a small niche of meristematic cells situated at the top of the shoot, termed shoot apical meristem (SAM), is responsible for most of the aerial growth of the plant. Endogenous and environmental signals that promote flowering are perceived at the leaf and the SAM, where their integration occurs. The transition to flowering is one of the most important transitions in the life of a plant, which in many species such as Arabidopsis is irreversible. The SAM responds by growing in size and altering its shape, leading to the change of the identity of the organs produced in its periphery, from leaves to flowers. Mutants with lower levels of the cytoplasmic HSP90 members show aberrant shoot architecture and phyllotaxy, as well as aberrant flowering time. To investigate the involvement of HSP90 in SAM homeostasis and in gene expression changes as a response to external or internal signals, we measured the flowering time under different photoperiods and SAM morphology on a cellular level in single mutants and RNAi lines of HSP90. Additionally, we examined the SAM morphology of hsp90/wus and hsp90/clv3 double mutants, confirming the important role for HSP90 in the regulation of SAM homeostasis. Using molecular and microscopic techniques, it was shown that HSP90 control the spatial expression of CLV3 and positively regulate WUS expression during vegetative growth. Lower levelsof HSP90 lead to deregulation of auxin responses in the SAM, as evidenced by ectopic expression of the biomarker DR5 and the auxin efflux carrier, PIN1. Also, in the absence of HSP90, Arabidopsis fails to change SAM size and shape in a controlled manner during the transition to flowering. Finally, the involvement of HSP90 in flowering time occurs both at the leaves and at the SAM, while lower levels of the chaperone lead to failure to regulate the flowering integrator genes of different pathways in a synchronized way and to induce the expression of floral meristem identity establishment genes. It is proposed that this effects can be attributed to the physical interaction of HSP90 with epigenetic regulators with important roles in flowering, such as members of the PRC2 complex or the demethylase, REF6, additionally or synergistically to their interaction with central transcription factors of this processes as shown in previous work. Additional evidence for this mechanism is offered by the localization of HSP90 at the chromatin of genes that take part in the flowering transition and establishment of floral meristem identity. In conclusion, the present dissertation presents further evidence for the roles of HSP90 in SAM homeostasis maintenance, the flowering transition and floral meristem establishment through their involvement in hormonal pathways that participate in these processes and through the control of gene expression, coordinating the responses to developmental (endogenous) and environmental (exogenous) signals.

Η HEAT SHOCK PROTEIN 90 (HSP90) οικογένεια πρωτεϊνών με δράση μοριακού συνοδού, αποτελεί συστατικό στοιχείο του συστήματος της πρωτεόστασης και είναι εξαιρετικά συντηρημένη μεταξύ φυλογενετικά απομακρυσμένων οργανισμών. Έχει δειχθεί ότι οι HSP90 διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής ομοιόστασης, εμπλέκονται σε πλήθος αναπτυξιακών μονοπατιών καθώς και στην εξελικτική διαδικασία. Χαρακτηρίζονται από επιλεκτικότητα ως προς τα υποστρώματά τους, τα οποία διατηρούν σε λειτουργική διαμόρφωση σε συνεργασία με μια πληθώρα βοηθητικών πρωτεΐνών που ονομάζονται συν-τσαπερόνες. Ενώ η δράση τους εξασκείται κυρίως στο κυτταρόπλασμα, στα μετάζωα έχει αρχίσει να αναδεικνύεται ο ρόλος τους στον πυρήνα και ειδικότερα στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης τόσο μέσω του ελέγχου της μεταγραφικής μηχανής όσο και μέσω της ρύθμισης της δομής της χρωματίνης. Στο φυτό Arabidopsis thaliana, η HSP90 οικογένεια αποτελείται από επτά μέλη εκ των οποίων τα τέσσερα είναι κυτταροπλασματικά, ενώ τα υπόλοιπα έχουν οργανιδιακή τοποθέτηση. Μέχρι στιγμής, οι κυριότεροι μηχανισμοί που έχουν περιγραφεί για τις HSP90 στο Arabidopsis αφορούν στον έλεγχο της λειτουργικότητας ή σταθερότητας κομβικών πρωτεϊνών σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος, όπως υποδοχείς, κινάσες ή μεταγραφικοί παράγοντες. Η συμμετοχή τους στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος των μπρασσινοστεροειδών (BR) και του γιασμονικού οξέως (JA) είναι θεμελιωμένη, ενώ πλέον έχει αρχίσει να αναδεικνύεται ο κεντρικός ρόλος τους στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος της αυξίνης. Αντιθέτως, δεν έχει διερευνηθεί η συμμετοχή των HSP90 στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος των γιββερελλινών (GA), που συνεργάζεται με το μονοπάτι των BR. Οι GA είναι φυτικές ορμόνες που προάγουν την αλλαγή από τη βλαστική στην αναπαραγωγική φάση ανάπτυξης και αποτελούν αρνητικό ρυθμιστή της δημιουργίας του άνθους. Μέσω ενός συνδυασμού μεθοδολογιών γενετικής ανάλυσης, βιοχημείας, μοριακής βιολογίας και μικροσκοπίας ταυτοποιήθηκε η φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ των HSP90.1 και ΗSP90.3 με δύο μέλη των DELLA πρωτεϊνών (RGA και GAI), που αποτελούν κεντρικούς αναστολείς του μονοπατιού των GA. Η ανάλυσή έδειξε ότι έλλειψη λειτουργίας του HSP90 μοριακού συνοδού (είτε φαρμακολογική είτε γενετική) οδηγεί σε απορρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων βιοσύνθεσης και καταβολισμού των GA καθώς και σε σταθεροποίηση των DELLA σε κύτταρα με μεγάλο δυναμικό επιμήκυνσης. Τα δεδομένα που προέκυψαν συνηγορούν υπέρ της εμπλοκής των HSP90 στο ορμονικό μονοπάτι μεταγωγής σήματος των GA καθώς και της λειτουργίας τους ως μόρια ενσωμάτωσης σημάτων που προέρχονται από ενδογενή προγράμματα ανάπτυξης. Μετά τη φύτρωση, η υπέργεια ανάπτυξη του φυτού οφείλεται σε έναν θώκο μεριστωματικών κυττάρων στην κορυφή του βλαστού, που είναι γνωστός ως ακραίο μερίστωμα του βλαστού (ΑΜΒ), περιοχή στην οποία ενσωματώνονται τα σινιάλα μετάβασης στην άνθιση. Η άνθιση είναι η πιο σημαντική μετάβαση στον κύκλο ζωής των φυτών και για κάποια είδη όπως το Arabidopsis είναι μη αντιστρεπτή. Ως απόκριση στα επαγωγικά σινιάλα, το ΑΜΒ αυξάνει σε μέγεθος και μεταβάλει το σχήμα του, με τελικό αποτέλεσμα την μεταβολή της ταυτότητας των πλάγιων οργάνων από φύλλα σε άνθη. Φυτικές σειρές με μειωμένα επίπεδα των κυτταροπλασματικών HSP90 χαρακτηρίζονται από ανωμαλίες στην αρχιτεκτονική του βλαστού και στην υπέργεια ανάπτυξή τους όπως και στη μετάβαση στην άνθιση. Γι’ αυτόν τον λόγο, στα πλαίσια της παρούσας διατριβής διερευνήθηκε περαιτέρω η εμπλοκή των HSP90 στον έλεγχοτης ομοιόστασης του μεριστώματος και στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης για το συντονισμό της ανάπτυξης με το περιβάλλον. Μελετήθηκε διεξοδικά ο χρόνος άνθισης σε διαφορετικές φωτοπεριόδους, και η αρχιτεκτονική του ΑΜΒ σε κυτταρικό επίπεδο διαγονιδιακών σειρών με χαμηλά επίπεδα HSP90 (hsp90 T-DNA μεταλλάγματα και αποσιωπημένες HSP90RNAi σειρές), καθώς επίσης και στα διπλά μεταλλάγματα hsp90/wus και hsp90/clv3, επιβεβαιώνοντας την εμπλοκή των HSP90 στη ρύθμιση της ομοιόστασης του ΑΜΒ και στην απόκρισή του σε ενδογενή και περιβαλλοντικά σινιάλα. Με τη χρήση μοριακών και μικροσκοπικών τεχνικών και κατάλληλων διαγονιδιακών σειρών δείχθηκε ότι οι HSP90 επηρεάζουν τη χωρική έκφραση του γονιδίου CLV3 και ρυθμίζουν θετικά την έκφραση του WUS στη βλαστική φάση ανάπτυξης. Επιπλέον, δείχθηκε ότι η μείωση των HSP90 επιπέδων διαταράσσει την απόκριση των κυττάρων του ΑΜΒ στην ορμόνη αυξίνη, αναλύοντας την έκφραση του βιοδείκτη DR5, και μελετώντας την τοποθέτηση του PIN1 μεταφορέα της αυξίνης. Επίσης, στην έλλειψη των HSP90 απορρυθμίζεται η συντονισμένη μεταβολή του μεγέθους και σχήματος του μεταβατικού ΑΜΒ. Τέλος, η συμμετοχή των HSP90 στη μετάβαση στην άνθιση γίνεται τόσο στο φύλλο όσο και στο ΑΜΒ. Στην έλλειψή των HSP90, επηρεάζεται ο συντονισμός της έκφρασης των κεντρικών γονιδίων ενσωμάτωσης των σινιάλων της άνθισης και η επαγωγή των γονιδίων εγκαθίδρυσης της ανθικής ταυτότητας. Η διερεύνηση της αλληλεπίδρασης των HSP90 με επιγενετικούς ρυθμιστές όπως τα REF6 και μέλη του PRC2 συμπλόκου, καθώς και η εξέταση της παρουσίας των HSP90 στο Arabidopsis σε γονιδιωματική κλίμακα, προσφέρει ενδείξεις για το σημαντικό ρόλο τους στη ρύθμιση της μετάβασης στην άνθιση και στην εγκαθίδρυση του ανθικού μεριστώματος μέσω της επιγενετικής ρύθμισης των γονιδίων που ρυθμίζουν αυτές τις διαδικασίες. Συνοπτικά, στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε ο ρόλος των HSP90 στη μετάβαση στην άνθιση και στην εγκαθίδρυση του ανθικού μεριστώματος, καθώς και η συμμετοχή τους στον ορμονικό έλεγχο αυτών των διαδικασιών. Επιπρόσθετα, διερευνήθηκε η εμπλοκή των HSP90 στον έλεγχο της ομοιόστασης του μεριστώματος και στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης για το συντονισμό της ανάπτυξης με το περιβάλλον.