Μελέτη βιοδεικτών σε παθολογικές κλινικές καταστάσεις με προηγμένες βιοαισθητηριακές μεθόδους

Abstract

Study of biomarkers in pathological clinical conditions with advanced biosensing methods. School of Applied Biology & Biotechnology Department of Biotechnology Abstract Prostate cancer is one of the most common male malignancies worldwide. In Greece, in 2022, it ranked first among male cancers. For many years, the determination of the prostate-specific antigen (PSA) in the blood has been the established cancer marker for screening every man over age of 45 years. Without underestimating the importance and value of clinical examination, billions are spent on the development of methods for the early and valid detection of this marker. An extensive review of both older and newer techniques used for this purpose, over the decades, has highlighted their costly and time-consuming nature despite the high sensitivity and specificity demonstrated by all these methods.In this study, which was conducted and completed in two phases, an advanced system for the detection of the prostate-specific antigen PSA in human serum was developed. This system based on a cell-based biosensor utilizing the Bioelectrical Identification Assay (BERA), which is potentially portable, low-cost and high-performance, allowing for use anywhere, outside the laboratory, near the patient.In the first phase, an advanced system for the detection of PSA in human serum was developed based on a cell-based biosensor where the cell membrane was modified via electroinsertion of a specific antibody against PSA. Thirty-nine human serum samples were used to validate this biosensor system for PSA detection. The samples were analyzed in parallel with a standard immunoradiometric Assay (IRMA), and an established Electrochemical Immunoassay was used for comparison purposes. In this phase, they were classified into three different PSA concentration ranges (0, <4 and ≥4 ng/mL). Cells modified with electroinsertion of 0.25 μg/mL PSA antibody into their membrane showed a statistically lower response against the higher PSA concentration range (≥4 ng/mL). Furthermore, the cell-based biosensor performed better than the immunosensor in terms of sensitivity and analysis of positive samples containing <4 ng/mL PSA. Despite the preliminary stage of development and the proof-of-principle nature, the cellular biosensor emerges as a promising basis for developing a rapid, cost effective, highly sensitive, and accurate Poin-of-Care (POC) screening system for PSA. During the second phase of experiments the working principle was confirmed, and a pilot clinical evaluation was achieved for a novel biosensor based on bioelectrical impedance methology for PSA detection in human serum. This system utilizes Molecular Identification through Membrane Engineering (MIME) technology combined with the xCELLigence real-time cell analysis platform, using Vero cells as biosensor, with anti-PSA antibodies attach to their membranes via electroporation (electroinsertion). Optimization experiments conducted in this phase determined that 15,000 cells/well was the optimal configuration for achieving the maximum impedance response. The biosensor exhibited specific, concentration-dependent changes in impedance during exposure to standard PSA solutions and demonstrated significant diagnostic capability in differentianing between PSA-positive and PSA-negative human serum samples, based on the established, internationally accepted clinical reference limit (cutoff) of 4 ng/mL. Furthermore, the biosensor provided rapid results within one minute, constituting a substantial advantage over the standard ImmunoradiometricAssay (IRMA) and the chemiluminescence metdod, while demonstrating strong diagnostic agreement. The specificity, sensitivity, and reproducibility of the system enhaced its potential for integration into point-of-care screening workflows. This bioelectrical assay represents one of the fastest PSA detection approaches reported to date and offers a promising solution for reducing prostate cancer overdiagnosis while improving valid and timely clinical decision-making, and consequently clinical patient outcomes. Scientific Area: Biosensors and Biomarkers KEY WORDS: Bioelectric Recognition Assay (BERA); cell-based biosensor; high throughput; impedance; Molecular Identification through Membrane Engineering (MIME); prostate cancer; prostate-specific antigen (PSA)

Μελέτη βιοδεικτών σε παθολογικές κλινικές καταστάσεις με προηγμένες βιοαισθητηριακές μεθόδους. Σχολή Εφαρμοσμένης Βιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τμήμα Βιοτεχνολογίας Εργαστήριο Κυτταρικής Τεχνολογιας Περίληψη Ο καρκίνος του προστάτη είναι από τις πιο συνηθισμένες κακοήθειες του άνδρα παγκόσμια. Στην Ελλάδα, το 2022, κατείχε την πρώτη θέση στους καρκίνους του άνδρα. Εδώ και πολλά χρόνια ο προσδιορισμός του ειδικού προστατικού αντιγόνου PSA στο αίμα αποτελεί τον καθιερωμένο καρκινικό δείκτη στον προσυμπτωματικό έλεγχο κάθε άντρα μεγαλύτερου των 45 ετών. Χωρίς να υποτιμάται η σημασία και η αξία της κλινικής εξέτασης, δισεκατομμύρια δαπανώνται για την ανάπτυξη μεθόδων έγκαιρης και έγκυρης ανίχνευσης του δείκτη αυτού. Στην εκτεταμένη ανασκόπηση στις παλαιότερες και στις νεώτερες τεχνικές που χρησιμοποιούνται, επί δεκαετίες, για τον σκοπό αυτό, διαπιστώθηκε η δαπανηρή και χρονοβόρα διαδικασία τους, παρά την υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα που επιδεικνύουν όλες αυτές οι μέθοδοι. Σε αυτή τη μελέτη, η οποία διεξήχθη και ολοκληρώθηκε σε δύο φάσεις, αναπτύχθηκε ένα προηγμένο σύστημα ανίχνευσης του ειδικού προστατικού αντιγόνου PSA σε ανθρώπινο ορό με βάση ένα βιοαισθητήρα στηριζόμενο σε κύτταρα, με τη μέθοδο της Βιοηλεκτρικής Αναγνώρισης (BERA), ο οποίος μπορεί να είναι φορητός, χαμηλού κόστους και υψηλής απόδοσης ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί οπουδήποτε, εκτός εργαστηρίου, πλησίον του εξεταζόμενου. Στην πρώτη φάση αναπτύχθηκε ένα προηγμένο σύστημα ανίχνευσης PSA σε ανθρώπινο ορό, με βάση έναν κυτταρικό βιοαισθητήρα όπου η κυτταρική μεμβράνη τροποποιήθηκε με ηλεκτροεισαγωγή ενός ειδικού αντισώματος κατά του PSA. Τριάντα εννέα δείγματα ανθρώπινου ορού χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση αυτού του βιοαισθητηριακού συστήματος για την ανίχνευση PSA. Τα δείγματα αναλύθηκαν παράλληλα με μια τυπική ανοσοραδιομετρική ανάλυση (IRMA) και χρησιμοποιήθηκε μια καθιερωμένη ηλεκτροχημική ανοσοδοκιμασία για σκοπούς σύγκρισης. Σε αυτή τη φάση τα δείγματα ταξινομήθηκαν σε τρεις διαφορετικές περιοχές συγκεντρώσεων PSA (0, <4 και ≥4 ng/mL). Κύτταρα που τροποποιήθηκαν με ηλεκτροεισαγωγή 0,25μg/mL αντίσωμα PSA στη μεμβράνη τους έδειξαν στατιστικά χαμηλότερη απόκριση έναντι του ανώτερου εύρους συγκεντρώσεων PSA (≥4 ng/mL). Επιπλέον, ο βιοαισθητήρας που βασίζεται σε κύτταρα απέδωσε καλύτερα από τον ανοσοαισθητήρα όσον αφορά την ευαισθησία και την ανάλυση έναντι θετικών δειγμάτων που περιέχουν PSA <4 ng/mL. Παρά το προκαταρκτικό στάδιο ανάπτυξης και την απόδειξη της αρχής λειτουργίας ο κυτταρικός βιοαισθητήρας αναδεικνύεται ως μια ελπιδοφόρα βάση για την ανάπτυξη ενός ταχέως, οικονομικά αποδοτικού, υψηλής ευαισθησίας και ακρίβειας συστήματος διαλογής στο σημείο φροντίδας (Point-of-Care, POC) για το PSA. Κατά τη δεύτερη φάση των πειραμάτων, επιτεύχθηκε η επικύρωση της αρχής λειτουργίας και η πιλοτική κλινική αξιολόγηση ενός νέου βιοαισθητήρα βασισμένου στη μεθοδολογία βιοηλεκτρικής σύνθετης αντίστασης για την ανίχνευση του PSA σε δείγματα ανθρώπινου ορού. Το εν λόγω σύστημα αξιοποιεί την τεχνολογία Μοριακής Ταυτοποίησης μέσω Μεμβρανικής Μηχανικής (MIME) σε συνδυασμό με την πλατφόρμα ανάλυσης κυττάρων σε πραγματικό χρόνο xCELLigence, χρησιμοποιώντας ως βιοϋποδοχείς κύτταρα Vero στη μεμβράνη των οποίων είχαν προσδεθεί με ηλεκτροεισαγωγή αντισώματα κατά του PSA. Τα πειράματα βελτιστοποίησης, που διενεργήθηκαν σε αυτή τη φάση, καθόρισαν τα 15.000 κύτταρα/φρεάτιο ως την άριστη διαμόρφωση για την επίτευξη της μέγιστης απόκρισης σύνθετης αντίστασης. Ο βιοαισθητήρας επέδειξε ειδικές, εξαρτώμενες από τη συγκέντρωση μεταβολές στην εμπέδηση (σύνθετη αντίσταση) κατά την έκθεση σε πρότυπα διαλύματα PSA και κατέδειξε σημαντική διαγνωστική ικανότητα διαφοροποίησης μεταξύ δειγμάτων ανθρώπινου ορού θετικών και αρνητικών για PSA, σε σχέση με το καθιερωμένο, αποδεκτό διεθνώς, κλινικό όριο αναφοράς των 4 ng/mL. Επιπλέον, ο βιοαισθητήρας παρείχε ταχέα αποτελέσματα εντός ενός λεπτού, γεγονός που συνιστά ουσιαστικό πλεονέκτημα έναντι της τυπικής ανοσοραδιομετρικής δοκιμασίας (IRMA) και της μεθόδου χημειοφωταύγειας, ενώ παράλληλα επέδειξε ισχυρή διαγνωστική συμφωνία. Η εξειδίκευση, η ευαισθησία και η αναπαραγωγιμότητα του συστήματος ενισχύουν τις δυνατότητές του για ενσωμάτωση σε ροές εργασίας ελέγχου στο σημείο φροντίδας (Point-of-Care, POC). Αυτή η βιοηλεκτρική δοκιμασία αντιπροσωπεύει μία από τις ταχύτερες προσεγγίσεις ανίχνευσης PSA, που έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα και προσφέρει μια πολλά υποσχόμενη λύση για τη μείωση της υπερδιάγνωσης του καρκίνου του προστάτη, βελτιώνοντας παράλληλα τη έγκυρη και έγκαιρη λήψη κλινικών αποφάσεων και συνεπώς την κλινική έκβαση των ασθενών. Επιστημονική περιοχή: Βιοαισθητήρες, Βιοδείκτες ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: Δοκιμασία Βιοηλεκτρικής Αναγνώρισης (BERA), Κυτταρικός βιοαισθητήρας, Σύνθετη αντίσταση, Μοριακή Ταυτοποίηση μέσω Μεμβρανικής Μηχανικής (MIME), Ειδικό Προστατικό Αντιγόνο (PSA)