Characterization of the physiological and molecular mechanisms regulating fruit pigmentation and development in sweet cherry (Prunus avium L.)

Abstract

The present thesis focuses on elucidating the physiological and molecular mechanisms underlying sweet cherry (Prunus avium L.) fruit development and ripening, with particular emphasis on the role of transcription factors regulating the expression of ripening-associated genes. Ripening in fleshy fruits represents a complex and tightly regulated biological process that involves a series of physiological, structural and metabolic modifications, which collectively determine fruit quality, flavor, and postharvest longevity. This research was based on a developmental experiment covering eight distinct stages of fruit development, beginning 32 days after full blossom and extending to the stage of commercial harvest. Within this framework, a metabolomic analysis was conducted on both fruit and pedicel tissues, revealing a clear separation between the early developmental and late ripening stages. Extensive transcriptomic analysis performed separately on the two tissues further uncovered key gene expression and metabolic processes occurring at the critical stage of color transition in sweet cherry. These processes are linked to commercially important quality traits such as skin pigmentation and fruit size. Additionally, according to the pedicel tissue, dynamic transcriptional activity was observed, highlighting its active involvement in nutrient transport, signaling and regulatory compound exchange with the fruit throughout ripening. To further understand the regulatory networks governing sweet cherry fruit ripening, functional analysis of key transcription factors identified during the study was performed. In particular, the transcription factors PaWRKY57 and PaNAC29 were found to act as important regulators of genes involved in the biosynthetic pathways of phenolic and volatile compounds as well as in abscisic acid signaling. Using RNA interference (RNAi), in combination with phenotypic, physiological and multi-omics data, their roles in these processes were confirmed. Furthermore, through GUS reporter assays and Western blot analysis, target genes whose expression is regulated by these transcription factors were identified. In summary, the present thesis aims to deepen our understanding of the molecular mechanisms underlying sweet cherry fruit development and ripening. By integrating multi-omics analyses, it highlights novel regulatory nodes linking metabolic and genetic changes in cherries to its physiology and phenotype. The findings provide valuable insights into the ripening process and the improvement of key sweet cherry fruit quality traits, laying the groundwork for future genetic improvement strategies in different cultivars.

Η παρούσα διατριβή εστιάζει στη διερεύνηση των φυσιολογικών και μοριακών μηχανισμών που διέπουν την ανάπτυξη και την ωρίμανση του καρπού της κερασιάς (Prunus avium L.), με ιδιαίτερη έμφαση στο ρόλο μεταγραφικών παραγόντων που ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων σχετιζόμενα με τη διαδικασία της ωρίμανσης. Η ωρίμανση των καρπών αποτελεί μια σύνθετη διαδικασία και ένα χρονικά καθορισμένο βιολογικό φαινόμενο, το οποίο περιλαμβάνει ποικίλες φυσιολογικές, δομικές και μεταβολικές τροποποιήσεις, καθοριστικές για την ποιότητα, τη γεύση και τη μετέπειτα μετασυλλεκτική ζωή του καρπού. Η παρούσα έρευνα βασίστηκε σε πείραμα που αφορούσε οκτώ διακριτά στάδια ανάπτυξης του καρπού, ξεκινώντας 32 ημέρες μετά την πλήρη άνθιση και ολοκληρώνοντας κατά το στάδιο της εμπορικής συγκομιδής του καρπού. Στο πλαίσιο αυτό, πραγματοποιήθηκε μεταβολομική ανάλυση, τόσο των καρπών όσο και των ποδίσκων, από την οποία προέκυψε σαφής διαφοροποίηση μεταξύ των πρώιμων σταδίων ανάπτυξης με τα αναπτυξιακά στάδια πιο προχωρημένης ωριμότητας. Εκτεταμένη μεταγραφομική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε ξεχωριστά για τους δύο ιστούς, αποκάλυψε σημαντικές γονιδιακές και μεταβολικές διεργασίες που λαμβάνουν χώρα στο κρίσιμο στάδιο της αλλαγής του χρώματος του κερασιού και σχετίζονται με ποιοτικά χαρακτηριστικά σημαντικά για την εμπορική ζωή του παραγόμενου καρπού, όπως το χρώμα της επιδερμίδας και το μέγεθός του. Επιπλέον, συγκεκριμένα για τον ιστό του ποδίσκου, προέκυψαν χρήσιμες πληροφορίες για την ενεργή σύνδεσή του με τον καρπό και τη συμμετοχή του στη μεταφορά θρεπτικών συστατικών και ρυθμιστικών μορίων, υπογραμμίζοντας τη δυναμική αλληλεπίδραση καρπού-ποδίσκου κατά την αναπτυξιακή διαδικασία. Στο πλαίσιο της κατανόησης των ρυθμιστικών δικτύων που διέπουν τη διαδικασία της ωρίμανσης του καρπού της κερασιάς, πραγματοποιήθηκε λειτουργική ανάλυση κρίσιμων μεταγραφικών παραγόντων που μεταβάλλονται κατά την αναπτυξιακή διαδικασία. Συγκεκριμένα, οι μεταγραφικοί παράγοντες PaWRKY57 και PaNAC29 διαπιστώθηκε ότι να δρουν ως σημαντικοί ρυθμιστές γονιδίων που σχετίζονται με τη μεταβολική οδό της βιοσύνθεσης φαινολικών και πτητικών ενώσεων, καθώς και της σηματοδότησης φυτοορμονών, και συγκεκριμένα του αμπσισικού οξέος. Μέσω της τεχνικής της RNA παρεμβολής, συνδυαστικά με φαινοτυπικά, φυσιολογικά και δεδομένα πολυ-ομικών αναλύσεων, επιβεβαιώθηκε ο ρόλος των PaWRKY57 και PaNAC29 στις προαναφερθείσες διαδικασίες. Επιπρόσθετα μέσω του συστήματος αναφοράς GUS και της ανοσοαποτύπωσης κατά Western, αναδείχθηκαν γονίδια-στόχοι των PaWRKY57 και PaNAC29. Συνοψίζοντας, η συγκεκριμένη μελέτη στοχεύει στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που ελέγχουν την ανάπτυξη και την ωρίμανση του καρπού της κερασιάς, αναδεικνύοντας μέσω πολύ-ομικών αναλύσεων, νέους ρυθμιστικούς κόμβους που συνδέουν μεταβολικές και γονιδιακές μεταβολές του καρπού με τη φυσιολογία του και το φαινότυπό του. Τα ευρήματα προσφέρουν πολύτιμη γνώση για την κατανόηση της διαδικασίας της ωρίμανσης και τη βελτίωση βασικών δεικτών της ποιότητας των καρπών της κερασιάς, αποτελώντας βάση για μελλοντικές στρατηγικές γενετικής βελτίωσης των ποικιλιών.