Utilization of microalgae for the recovery and encapsulation of bioactive ingredients using novel processes for the food industry

Abstract

In recent years, scientific and industrial interest in microalgae as an alternative non-animal source of natural bioactive and functional compounds has been rapidly increasing. Among microalgae, Auxenochlorella pyrenoidosa (formerly known as Chlorella pyrenoidosa), Arthrospira platensis (commercially known as Spirulina), and Crypthecodinium cohnii are three species rich in bioactive and functional ingredients, such as proteins, antioxidants, natural pigments, and polyunsaturated fatty acids. Auxenochlorella pyrenoidosa and A. platensis stand out due to their high content in proteins containing all the essential amino acids, making them suitable for application in a variety of food products, due to their functional and emulsifying properties, such as good water- and oil-holding capacities, high emulsifying capacity, and high emulsion stability, all of which were studied in the present thesis. Except for functional proteins, A. pyrenoidosa contains significant amounts of natural pigments, such as chlorophylls and lutein, which are valuable bioactive compounds and can be applied in the food industry as natural food colorants. Lutein is additionally characterized by strong antioxidant properties. Arthrospira platensis is well known for the production of C-phycocyanin (C-PC), a blue-color protein with antioxidant properties. Crypthecodinium cohnii stands out due to the accumulation of high amounts of polyunsaturated fatty acids (PUFAs). The PUFA content of C. cohnii reaches a value above 40% of its dry mass, while 30-60% of the accumulated PUFAs is docosahexaenoic acid (DHA). Due to its unique fatty acid composition, C. cohnii has been commercially employed for the production of DHA. Because of the rigidity of the cell wall of the aforementioned microalgae, effective cell disruption methods are required to recover the intracellular compounds, while simultaneously avoiding their degradation. This can be achieved by applying nonthermal technologies for cell disruption, such as pulsed electric fields (PEF) and high pressure homogenization (HPH). Additionally, due to the spherical shape and the durability of A. pyrenoidosa cells, these edible microalgae can also be applied as wall material for the encapsulation of other bioactive compounds, increasing their nutritional value with a simultaneous protection of the encapsulated ingredients. The encapsulation into microalgal cells could also be improved by the increase of permeabilization via cell disruption technologies, while the utilization of the cellular extraction residues as encapsulation matrices can contribute to the valorization of this byproduct. The aim of this thesis was the investigation of the effect of PEF and HPH on the extraction of bioactive and functional ingredients from A. pyrenoidosa, A. platensis, and C. cohnii biomass, as well as the mathematical evaluation of the extraction process in terms of several extraction parameters, namely PEF and HPH treatment conditions, extraction solvent, temperature, and time. Additionally, the study of the functional and emulsifying properties of the recovered proteins and the efficient encapsulation of other bioactive ingredients (oregano essential oil and lycopene) into the A. pyrenoidosa cells and the cellular residues of the extraction processes fell within the scope of this research, aiming to a holistic exploitation approach of microalgal biomass. Regarding the experimental procedure, A. pyrenoidosa, A. platensis, and C. cohnii suspensions (2.5% w/w) were treated under to various PEF treatment conditions (electric field strength 4.6 kV/cm with specific energy 53.8-179.2 kJ/kg for A. pyrenoidosa, 7.8 kV/cm with 3.9-137.6 kJ/kg for A. platensis, and 11.0-13.5 kV/cm with 102.6-167.7 kJ/kg for C. cohnii), while A. pyrenoidosa was also treated with HPH at 400-800 bar for 1 and 4 passes. For the extraction of chlorophylls and lutein from A. pyrenoidosa, untreated and PEF-treated biomass was incubated in ethanol solutions (75-95% v/v) at 30-60 °C for up to 6 h. The extracts (supernatant liquids) were analyzed in terms of their chlorophyll and lutein concentrations and their antioxidant activity. For the extraction of proteins and C-PC from A. platensis, untreated and PEF-treated suspensions were incubated at 30-50 °C for up to 24 h. The extracts were analyzed in terms of their protein and C-PC concentrations, and their purity in C-PC. For the extraction of DHA from C. cohnii, untreated and PEF-treated biomass was incubated at different extraction solvent mixtures containing chloroform, methanol, ethanol, hexane, and isopropanol in various ratios, at ambient temperature for up to 6 h. The DHA recovery yield and the composition of the recovered oils were analyzed. The extraction kinetics of chlorophylls from A. pyrenoidosa and DHA from C. cohnii were mathematically described by a first order fractional model, while the extraction kinetics of proteins and C-PC from A. platensis were described by a four-parameter logistic nonlinear model. For the extraction of proteins from A. pyrenoidosa, untreated and HPH-treated suspensions were incubated at 20-40 °C for up to 24 h. The extracts were analyzed in terms of their protein concentration. Then, the recovered proteins were precipitated and lyophilized for the determination of their secondary structure and functional properties (water- and oil- holding capacity, foaming capacity and stability, surface and interfacial tension). The optimum HPH conditions in terms of protein recovery and modification were chosen for the development of oil in water nanoemulsions (oil content 2-6% w/w) using one-step (high speed homogenization, HSH) and two-step (HSH and HPH) homogenization methods. The particle-size distribution of the nanoemulsions was measured during storage at different temperatures (4-25 °C) and after freeze-thaw, heating-cooling, and centrifugation cycles. The optimum nanoemulsions were used as lycopene delivery systems, and the lycopene deterioration during storage at 25-60 °C was studied. For the application of A. pyrenoidosa cells as encapsulation matrices, microalgal suspensions (2.5% w/w) were mixed separately in different cell-to-oil ratios (2:4, 3:4, and 4:4) with oregano essential oil (OEO) and lycopene (0.1% w/w in sunflower oil), using HSH (8000 rpm, 10 min). After HSH, the mixtures were treated with HPH (200-800 bar, 1-4 passes) for the enhancement of encapsulation and the cellular capsules were collected and lyophilized. The capsules were analyzed in terms of their encapsulation load (EL) and efficiency (EE). The stability of the developed capsules was evaluated during storage at different temperatures (10-50 °C) and water activities (0.431-0.982). For the valorization of the cellular residues from the extraction process, the same experimental procedure (except for the HPH treatment after HSH) was followed. Results showed that higher PEF treatment specific energy, ethanolic content in the extraction solvent, and incubation temperature led to higher recovery of chlorophyll and lutein from A. pyrenoidosa. Chlorophyll characteristic extraction time (τchl) depended only on the incubation temperature with a strong reverse dependence (2.16 h at 30 °C vs. 0.61 h at 40 °C). A PEF treatment with 179.2 kJ/kg specific energy prior to incubation with 95% v/v ethanol at 60 °C for 4 h led to maximum recovery of both chlorophyll and lutein (18.2 and 1.17 mg/g dry biomass, respectively). Lutein was extracted more selectively at 30 °C, which led to extracts with higher concentration in antioxidants, namely 28.83 mg Trolox/g dry extract for samples treated with specific energy of 179.2 kJ/kg and a four-hour extraction with 95% v/v ethanol. The increase in PEF treatment-specific energy and incubation temperature (up to 40 °C) led to faster recovery of proteins and C-PC from A. platensis. The characteristic extraction time for C-PC was reduced from 14.0 (untreated) to 9.7 h when a PEF treatment of 137.6 kg/kJ was applied before extraction at 30 °C. Increasing the incubation temperature from 30 to 40 °C further accelerated the extraction process in PEF-treated biomass, reducing the characteristic C-PC extraction time (τC-PC) from 9.7 to 3.2 h. Additionally, this PEF treatment resulted in extracts with a higher C-PC purity factor compared to those from untreated samples. A PEF treatment at an electric field strength of 13.5 kV/cm with a specific energy of 167.7 kJ/kg significantly improved DHA recovery from C. cohnii using isopropanol and ethanol as extraction solvents, increasing the DHA recovery yield by 11% and 73%, respectively. This PEF treatment also reduced the equivalent DHA extraction time (t90(UT)) by 50% and 80% when isopropanol and ethanol were used, respectively. Additionally, the use of these green solvents resulted in oils richer in DHA compared to those obtained with chloroform–methanol 2:1. As far as the extraction of proteins from A. pyrenoidosa with HPH treatment is concerned, more intense HPH treatment conditions (higher pressure and number of passes) and higher incubation temperature led to a significant increase in protein recovery. A four-pass HPH treatment at 800 bar resulted in maximization of protein recovery (382.0 mg proteins per g dry biomass after incubation at 40 °C for 24 h). Protein characteristic extraction time (τ) was significantly dependent on pretreatment conditions and incubation temperature (5.16 h for untreated biomass at 20 °C vs. 1.34 h for treated biomass at 800 bar with 4 passes at 40 °C). In all cases, the application of nonthermal technologies resulted in higher recovery yields of the target compounds. This fact, combined with the low PEF and HPH treatment cost, led to significant reductions of total process cost per g of recovered compound (including electrical energy and extraction solvent cost) up to 45% compared to the respective processes of the untreated samples.Regarding the effect of HPH treatment on the structure of the recovered proteins, the increase of pressure led to the reduction of α-helix and β-sheet structures, exposing the hydrophobic protein core. This protein modification led to A. pyrenoidosa protein concentrates (APPC) with increased oil-holding capacity (2.83 g oil/g APPC). The surface tension of APPC solutions reached a minimum value of 28.6 mN/m at an APPC concentration of 2% w/w. The two-step homogenization method (HSH and HPH) led to significantly smaller oil droplets with narrow size distribution, leading to more stable nanoemulsions with improved resistance to centrifugation and heating-cooling cycles. Low intense HPH treatment conditions (200 bar, 2 passes) led to maximization of EL of OEO and lycopene at 38.3 mg OEO and 3.6 mg lycopene per 100 mg dry capsules (21% and 28% increase compared to untreated samples, respectively). Due to the higher degree of cell disruption at pressures greater than 300 bar, the values of EL were significantly reduced. The OEO capsules were more stable at water activities lower than 0.923, even at 50 °C after 15 d (encapsulated OEO release lower than 10%). Regarding the lycopene capsules, they were more stable at water activities higher than 0.960 at temperatures lower than 10 °C, even after 30 d of storage (encapsulated lycopene degradation lower than 20%). This study demonstrated the industrial potential of A. pyrenoidosa, A. platensis, and C. cohnii as a sustainable source of natural bioactive and functional compounds, emphasizing the role of nonthermal technologies in enhancing extraction efficiency and extract functionality. The optimized PEF and HPH treatments enabled selective and high-yield recovery of chlorophylls, lutein, proteins, C-PC, and DHA from microalgal biomass, while reducing the total process cost per g of recovered ingredient. The developed mathematical models are valuable industrial tools for accurate prediction of extraction yield and estimation of extraction efficiency for different process parameter combinations. The recovered proteins exhibited improved functional and emulsifying properties, while A. pyrenoidosa cells and the extraction cellular residues were efficiently used as encapsulation matrices for OEO and lycopene encapsulation, improving their stability during storage. These findings support the holistic exploitation of A. pyrenoidosa biomass, reducing waste and increasing its applicability within the food industry.

Τα τελευταία χρόνια, το επιστημονικό και βιομηχανικό ενδιαφέρον για τα μικροφύκη ως εναλλακτική μη ζωική πηγή φυσικών βιοδραστικών και βιολειτουργικών ενώσεων έχει αυξηθεί ραγδαία. Μεταξύ των μικροφυκών, τα Auxenochlorella pyrenoidosa (παλαιότερα γνωστό ως Chlorella pyrenoidosa), Arthrospira platensis (εμπορικά γνωστό ως Spirulina) και Crypthecodinium cohnii είναι τρία είδη πλούσια σε βιοδραστικά και βιολειτουργικά συστατικά, όπως πρωτεΐνες, αντιοξειδωτικές πολυφαινολικές ενώσεις, φυσικές χρωστικές και πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Τα A. pyrenoidosa και A. platensis ξεχωρίζουν λόγω της υψηλής περιεκτικότητάς τους σε πρωτεΐνες που περιέχουν όλα τα απαραίτητα αμινοξέα, γεγονός που τις καθιστά κατάλληλες για εφαρμογές σε πληθώρα τροφίμων, λόγω των καλών λειτουργικών και γαλακτωματοποιητικών τους ιδιοτήτων, όπως η ικανότητα κατακράτησης νερού και ελαίου και η υψηλή γαλακτωματοποιητική τους ικανότητα, οι οποίες μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Εκτός από τις βιολειτουργικές πρωτεΐνες, το μικροφύκος A. pyrenoidosa περιέχει σημαντικές ποσότητες φυσικών χρωστικών, όπως χλωροφύλλες και λουτεΐνη, οι οποίες είναι πολύτιμες βιοδραστικές ενώσεις που μπορούν να εφαρμοστούν στη βιομηχανία τροφίμων ως φυσικές χρωστικές τροφίμων, ενώ η λουτεΐνη χαρακτηρίζεται επιπλέον από ισχυρές αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Το μικροφύκος A. platensis ξεχωρίζει για την παραγωγή C-φυκοκυανίνης (C-PC), μιας πρωτεΐνης μπλε χρώματος με αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Το μικροφύκος C. cohnii ξεχωρίζει λόγω της ενδοκυτταρικής παραγωγής υψηλών ποσοτήτων πολυακόρεστων λιπαρών οξέων. Η περιεκτικότητα του C. cohnii σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα μπορεί να ξεπεράσει το 40% της ξηρής του μάζας, ενώ το 30-60% αυτών είναι εικοσιδιεξαενοϊκό οξύ (docosahexaenoic acid, DHA). Λόγω της σύνθεσης λιπαρών οξέων του, το C. cohnii έχει χρησιμοποιηθεί εμπορικά για την παραγωγή DHA. Λόγω της αυξημένης σκληρότητας του κυτταρικού τοιχώματος των προαναφερθέντων μικροφυκών, απαιτούνται μέθοδοι διάρρηξης των κυττάρων για την ανάκτηση των ενδοκυτταρικών συστατικών, αποτρέποντας ταυτόχρονα την αλλοίωσή τους. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με την εφαρμογή μη θερμικών τεχνολογιών κυτταρικής διάρρηξης, όπως τα παλμικά ηλεκτρικά πεδία (ΠΗΠ) και η ομογενοποίηση υψηλής πίεσης (ΟΥΠ). Επιπλέον, λόγω του σφαιρικού σχήματος και της ανθεκτικότητας των κυττάρων του βρώσιμου μικροφύκους A. pyrenoidosa, αυτά μπορούν επίσης να εφαρμοστούν ως μικροκάψουλες για την ενθυλάκωση άλλων βιοδραστικών ενώσεων, αυξάνοντας τη διατροφική τους αξία με ταυτόχρονη ενίσχυση της προστασίας των ενθυλακωμένων συστατικών. Η ενθυλάκωση σε κύτταρα μικροφυκών δύναται επίσης να βελτιωθεί με την αύξηση της διαπερατότητας των κυττάρων μέσω των προαναφερθεισών τεχνολογιών κυτταρικής διάρρηξης, ενώ η αξιοποίηση των κυτταρικών υπολειμμάτων της εκχύλισης ως μήτρες ενθυλάκωσης μπορεί να συμβάλει στην αξιοποίηση αυτού του παραπροϊόντος. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της επίδρασης των ΠΗΠ και ΟΥΠ στην εκχύλιση βιοδραστικών και βιολειτουργικών συστατικών από βιομάζα μικροφυκών A. pyrenoidosa, A. platensis και C. cohnii, καθώς και η μαθηματική μοντελοποίηση των διεργασιών εκχύλισης ως προς τις παραμέτρους αυτών, οι οποίες ήταν οι συνθήκες επεξεργασίας με ΠΗΠ και ΟΥΠ, ο διαλύτης εκχύλισης, η θερμοκρασία και ο χρόνος εκχύλισης. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε μελέτη των λειτουργικών και γαλακτωματοποιητικών ιδιοτήτων των ανακτημένων πρωτεϊνών από το μικροφύκος A. pyrenoidosa και η ενθυλάκωση άλλων βιοδραστικών συστατικών (αιθέριο έλαιο ρίγανης και λυκοπένιο) στα κύτταρα του μικροφύκους A. pyrenoidosa και στα κυτταρικά υπολείμματα των εκχυλίσεων που εμπίπτουν στα πλαίσια αυτής της μελέτης, με στόχο την ολιστική αξιοποίηση της βιομάζας των μικροφυκών. Σχετικά με την πειραματική διαδικασία, αιωρήματα A. pyrenoidosa, A. platensis και C. cohnii (2,5% w/w) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε διαφορετικές συνθήκες επεξεργασίας με ΠΗΠ (ένταση ηλεκτρικού πεδίου 4,6 kV/cm με ειδική ενέργεια 53,8-179,2 kJ/kg για το μικροφύκος A. pyrenoidosa, 7,8 kV/cm με 3,9-137,6 kJ/kg για το μικροφύκος A. platensis και 11,0-13,5 kV/cm με 102,6-167,7 kJ/kg για το μικροφύκος C. cohnii), ενώ η βιομάζα του μικροφύκους A. pyrenoidosa υποβλήθηκε επίσης σε επεξεργασία με ΟΥΠ στα 400-800 bar για 1 και 4 περάσματα. Για την εκχύλιση χλωροφύλλων και λουτεΐνης από το μικροφύκος A. pyrenoidosa, ανεπεξέργαστη και επεξεργασμένη με ΠΗΠ βιομάζα επωάστηκε σε υδατικά διαλύματα αιθανόλης (75-95% v/v) στους 30-60 °C για έως και 6 h. Τα εκχυλίσματα (υπερκείμενα υγρά) αναλύθηκαν ως προς τις συγκεντρώσεις χλωροφύλλης και λουτεΐνης, καθώς και ως προς την αντιοξειδωτική τους ικανότητα. Για την εκχύλιση πρωτεϊνών και C-PC από το μικροφύκος A. platensis, ανεπεξέργαστα και επεξεργασμένα με ΠΗΠ αιωρήματα επωάστηκαν στους 30-50 °C για έως και 24 h. Τα εκχυλίσματα αναλύθηκαν ως προς τις συγκεντρώσεις πρωτεΐνης και C-PC, ενώ παράλληλα προσδιορίστηκε και η καθαρότητά τους σε C-PC. Για την εκχύλιση DHA από το μικροφύκος C. cohnii, ανεπεξέργαστη και επεξεργασμένη με ΠΗΠ βιομάζα επωάστηκε σε διαφορετικά μείγματα διαλυτών εκχύλισης που περιείχαν χλωροφόρμιο, μεθανόλη, αιθανόλη, εξάνιο και ισοπροπανόλη σε διάφορες αναλογίες, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για έως και 6 h και προσδιορίστηκε η απόδοση ανάκτησης DHA και η σύνθεση των ανακτημένων ελαίων. Η κινητική εκχύλισης των χλωροφυλλών από το μικροφύκος A. pyrenoidosa και του DHA από το μικροφύκος C. cohnii περιγράφηκε μαθηματικά από ένα κλασματικό μοντέλο πρώτης τάξης, ενώ η κινητική εκχύλισης των πρωτεϊνών και της C-PC από το μικροφύκος A. platensis περιγράφηκε από ένα μη γραμμικό λογιστικό μοντέλο τεσσάρων παραμέτρων. Για την εκχύλιση των πρωτεϊνών από το μικροφύκος A. pyrenoidosa, ανεπεξέργαστα και επεξεργασμένα με ΟΥΠ αιωρήματα βιομάζας επωάστηκαν στους 20-40 °C για έως και 24 h και τα εκχυλίσματα αναλύθηκαν ως προς τη συγκέντρωσή τους σε πρωτεΐνες. Στη συνέχεια, οι ανακτημένες πρωτεΐνες καταβυθίστηκαν και λυοφιλιώθηκαν για τον προσδιορισμό της δευτεροταγούς δομής τους και των λειτουργικών τους ιδιοτήτων (ικανότητα κατακράτησης νερού και ελαίου, ικανότητα και σταθερότητα αφρισμού, επιφανειακή και διεπιφανειακή τάση). Οι βέλτιστες συνθήκες επεξεργασίας με ΟΥΠ ως προς την ανάκτηση και τροποποίηση των πρωτεϊνών επιλέχθηκαν για την ανάπτυξη νανογαλακτωμάτων ελαίου σε νερό (περιεκτικότητα σε έλαιο 2-6% w/w) χρησιμοποιώντας μεθόδους ομογενοποίησης ενός (ομογενοποίηση υψηλής ταχύτητας, ΟΥΤ) και δύο σταδίων (ΟΥΤ και ΟΥΠ). Ύστερα, μετρήθηκε η κατανομή μεγέθους των σωματιδίων ελαίου των νανογαλακτωμάτων κατά την αποθήκευση σε διαφορετικές θερμοκρασίες (4-25 °C) και μετά από κύκλους κατάψυξης-απόψυξης, θέρμανσης-ψύξης και φυγοκέντρησης. Τα βέλτιστα νανογαλακτώματα χρησιμοποιήθηκαν ως συστήματα εγκλεισμού και μεταφοράς λυκοπενίου και μελετήθηκε η υποβάθμισή του κατά την αποθήκευση στους 25-60 °C. Για την εφαρμογή κυττάρων A. pyrenoidosa ως φορείς ενθυλάκωσης, κυτταρικά αιωρήματα (2,5% w/w) αναμίχθηκαν ξεχωριστά σε διαφορετικές αναλογίες κυττάρων-ελαίου (2:4, 3:4 και 4:4) με αιθέριο έλαιο ρίγανης (ΟΕΟ) και λυκοπένιο (0,1% w/w σε ηλιέλαιο), χρησιμοποιώντας ΟΥΤ (8000 rpm, 10 min). Μετά την OYT, τα μείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με OYΠ (200-800 bar, 1-4 περάσματα) για την ενίσχυση της ενθυλάκωσης και οι κυτταρικές κάψουλες συλλέχθηκαν και λυοφιλιώθηκαν. Οι κάψουλες αναλύθηκαν ως προς το φορτίο ενθυλάκωσης (EL) και την αποδοτικότητα ενθυλάκωσης (EE). Στη συνέχεια, μελετήθηκε η σταθερότητα των καψουλών κατά την αποθήκευση σε διαφορετικές θερμοκρασίες (10-50 °C) και ενεργότητες νερού (0,431-0,982). Για την αξιοποίηση των κυτταρικών υπολειμμάτων από τη διεργασία της εκχύλισης, ακολουθήθηκε η ίδια πειραματική διαδικασία, εκτός από την επεξεργασία με ΟΥΠ μετά την ΟΥΤ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ψηλότερη ειδική ενέργεια επεξεργασίας ΠΗΠ, περιεκτικότητα αιθανόλης στον διαλύτη εκχύλισης και θερμοκρασία επώασης οδήγησαν σε υψηλότερη ανάκτηση χλωροφυλλών και λουτεΐνης από το μικροφύκος A. pyrenoidosa. Ο χαρακτηριστικός χρόνος εκχύλισης χλωροφυλλών (τchl) βρέθηκε να παρουσιάζει έντονη αντίστροφη εξάρτηση μόνο από τη θερμοκρασία επώασης (2,16 h στους 30 °C έναντι 0,61 h στους 40 °C). Μια επεξεργασία με ΠΗΠ ειδικής ενέργειας 179,2 kJ/kg πριν από την επώαση με 95% v/v αιθανόλη στους 60 °C για 4 h οδήγησε σε μέγιστη ανάκτηση τόσο των χλωροφυλλών όσο και της λουτεΐνης (18,2 και 1,17 mg/g ξηρής βιομάζας, αντίστοιχα). Η λουτεΐνη εκχυλίστηκε πιο επιλεκτικά στους 30 °C, γεγονός που οδήγησε σε εκχυλίσματα με υψηλότερη συγκέντρωση αντιοξειδωτικών, η οποία βρέθηκε ίση με 28,83 mg Trolox/g ξηρού εκχυλίσματος για δείγματα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία ΠΗΠ με ειδική ενέργεια 179,2 kJ/kg και 4 h εκχύλισης με 95% v/v αιθανόλη. Η αύξηση της ειδικής ενέργειας επεξεργασίας με ΠΗΠ και της θερμοκρασίας επώασης έως και τους 40 °C οδήγησε σε ταχύτερη ανάκτηση πρωτεϊνών και C-PC από το μικροφύκος A. platensis. Ο χαρακτηριστικός χρόνος εκχύλισης για την C-PC (τC-PC) μειώθηκε από 14,0 (ανεπεξέργαστο δείγμα) σε 9,7 h όταν εφαρμόστηκε επεξεργασία με ΠΗΠ με ειδική ενέργεια επεξεργασίας 137,6 kg/kJ πριν από την εκχύλιση στους 30 °C. Η αύξηση της θερμοκρασίας επώασης από 30 σε 40 °C επιτάχυνε τη διεργασία της εκχύλισης από επεξεργασμένη με ΠΗΠ βιομάζα, μειώνοντας τον χαρακτηριστικό χρόνο εκχύλισης C-PC από 9,7 σε 3,2 h. Επιπλέον, αυτή η συνθήκη επεξεργασίας με ΠΗΠ είχε ως αποτέλεσμα την παραλαβή εκχυλισμάτων με υψηλότερο συντελεστή καθαρότητας C-PC σε σύγκριση με εκείνα από τα ανεπεξέργαστα δείγματα. Η επεξεργασία με ΠΗΠ με ένταση ηλεκτρικού πεδίου 13,5 kV/cm και ειδική ενέργεια 167,7 kJ/kg βελτίωσε σημαντικά την ανάκτηση DHA από το μικροφύκος C. cohnii χρησιμοποιώντας ισοπροπανόλη και αιθανόλη ως διαλύτες εκχύλισης, αυξάνοντας την απόδοση ανάκτησης DHA κατά 11 και 73%, αντίστοιχα. Αυτή η συνθήκη επεξεργασίας με ΠΗΠ οδήγησε, επίσης, στη μείωση του ισοδύναμου χρόνου εκχύλισης DHA (t90(UT)) κατά 50 και 80% όταν χρησιμοποιήθηκαν ισοπροπανόλη και αιθανόλη, αντίστοιχα. Επιπλέον, η χρήση αυτών των πράσινων διαλυτών είχε ως αποτέλεσμα την παραλαβή ελαίων πλουσιότερων σε DHA σε σύγκριση με αυτά που παραλήφθηκαν με χλωροφόρμιο-μεθανόλη 2:1. Όσον αφορά στην εκχύλιση πρωτεϊνών από A. pyrenoidosa με εφαρμογή ΟΥΠ, εντονότερες συνθήκες επεξεργασίας με ΟΥΠ (υψηλότερη πίεση και αριθμός περασμάτων) και η υψηλότερη θερμοκρασία επώασης οδήγησαν σε σημαντική αύξηση της ανάκτησης πρωτεϊνών. Μια επεξεργασία με ΟΥΠ τεσσάρων περασμάτων στα 800 bar είχε ως αποτέλεσμα τη μεγιστοποίηση της ανάκτησης πρωτεϊνών (382,0 mg ανά g ξηρής βιομάζας μετά από επώαση στους 40 °C για 24 h). Ο χαρακτηριστικός χρόνος εκχύλισης των πρωτεϊνών (τ) βρέθηκε να εξαρτάται σημαντικά από τις συνθήκες προεπεξεργασίας και τη θερμοκρασία επώασης (5,16 h για ανεπεξέργαστη βιομάζα στους 20 °C έναντι 1,34 h για επεξεργασμένη βιομάζα στα 800 bar με 4 περάσματα στους 40 °C). Σε όλες τις περιπτώσεις, η εφαρμογή των μη θερμικών τεχνολογιών είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των αποδόσεων ανάκτησης των στοχευόμενων ενώσεων. Αυτό το γεγονός, σε συνδυασμό με το χαμηλό κόστος επεξεργασίας με ΠΗΠ και ΟΥΠ, οδήγησε σε σημαντικές μειώσεις του συνολικού κόστους της διεργασίας ανά g ανακτημένης ένωσης (συμπεριλαμβανομένης της ηλεκτρικής ενέργειας και του κόστους του διαλύτη εκχύλισης) έως και κατά 45% σε σύγκριση με τις αντίστοιχες διεργασίες των μη επεξεργασμένων δειγμάτων. Όσον αφορά στην επίδραση της ΟΥΠ στη δομή των ανακτημένων πρωτεϊνών, η αύξηση της πίεσης οδήγησε στη μείωση των α-ελίκων και β-φύλλων, εκθέτοντας τον υδρόφοβο πυρήνα των πρωτεϊνών. Αυτή η τροποποίηση των πρωτεϊνών οδήγησε σε πρωτεϊνικά συμπυκνώματα A. pyrenoidosa (APPC) με αυξημένη ικανότητα κατακράτησης ελαίου (2,83 g ελαίου/g APPC). Η επιφανειακή τάση των διαλυμάτων APPC έφτασε στην ελάχιστη τιμή των 28,6 mN/m2 σε συγκέντρωση APPC 2% w/w. Η μέθοδος ομογενοποίησης δύο σταδίων (ΟΥΤ και ΟΥΠ) οδήγησε σε σημαντικά μικρότερα σταγονίδια ελαίου με στενή κατανομή μεγέθους, οδηγώντας σε πιο σταθερά νανογαλακτώματα με βελτιωμένη αντοχή στη φυγοκέντρηση και σε κύκλους θέρμανσης-ψύξης. Συνθήκες χαμηλής έντασης επεξεργασίας με ΟΥΠ (200 bar, 2 περάσματα) οδήγησαν σε μεγιστοποίηση του EL του OEO και του λυκοπενίου στα 38,3 mg OEO και 3,6 mg λυκοπενίου ανά 100 mg ξηρών καψουλών (αύξηση κατά 21 και 28% σε σύγκριση με τα ανεπεξέργαστα δείγματα, αντίστοιχα). Λόγω του υψηλότερου βαθμού κυτταρικής διάρρηξης σε πιέσεις μεγαλύτερες από 300 bar, οι τιμές του EL μειώθηκαν σημαντικά. Οι κάψουλες OEO ήταν πιο σταθερές σε ενεργότητες νερού χαμηλότερες από 0,92, ακόμη και στους 50 °C μετά από 15 d (απελευθέρωση ενθυλακωμένου OEO χαμηλότερη από 10%). Όσον αφορά στις κάψουλες λυκοπενίου, βρέθηκε να παρουσιάζουν αυξημένη σταθερότητα σε ενεργότητες νερού υψηλότερες από 0,96 και στη θερμοκρασία αποθήκευσης των 10 °C, ακόμη και μετά από 30 d αποθήκευσης (αποικοδόμηση ενθυλακωμένου λυκοπενίου χαμηλότερη από 20%). Αυτή η μελέτη εστίασε στις δυνατότητες βιομηχανικών εφαρμογών των μικροφυκών A. pyrenoidosa, A. platensis και C. cohnii ως βιώσιμες πηγές φυσικών βιοδραστικών και βιολειτουργικών συστατικών, δίνοντας έμφαση στον ρόλο των μη θερμικών τεχνολογιών στη βελτίωση της διεργασίας εκχύλισης και της λειτουργικότητας των ανακτημένων ενώσεων. Οι βέλτιστες συνθήκες επεξεργασίας με ΠΗΠ και ΟΥΠ επέτρεψαν την επιλεκτική και υψηλής απόδοσης ανάκτηση χλωροφυλλών, λουτεΐνης, πρωτεϊνών, C-PC και DHA από βιομάζα μικροφυκών, μειώνοντας το συνολικό κόστος της διεργασίας ανά g ανακτημένου συστατικού (συμπεριλαμβανομένης της ηλεκτρικής ενέργειας και του κόστους του διαλύτη εκχύλισης). Τα μαθηματικά μοντέλα που αναπτύχθηκαν αποτελούν πολύτιμα βιομηχανικά εργαλεία για την ακριβή πρόβλεψη της απόδοσης της εκχύλισης και την εκτίμηση της αποτελεσματικότητάς της για διαφορετικούς συνδυασμούς παραμέτρων κάθε διεργασίας. Οι ανακτημένες πρωτεΐνες παρουσίασαν βελτιωμένες λειτουργικές και γαλακτωματοποιητικές ιδιότητες, ενώ τα κύτταρα του μικροφύκους A. pyrenoidosa και τα κυτταρικά υπολείμματα των εκχυλίσεων χρησιμοποιήθηκαν αποτελεσματικά ως μικροκάψουλες για την ενθυλάκωση αιθερίου ελαίου ρίγανης και λυκοπενίου, βελτιώνοντας τη σταθερότητά τους κατά την αποθήκευση. Αυτά τα ευρήματα αποσκοπούν στην ολιστική αξιοποίηση της βιομάζας A. pyrenoidosa, αξιοποιώντας τα κυτταρικά υπολείμματα των εκχυλίσεων, αναδεικνύοντας νέες εφαρμογές αυτού του μικροφύκους στη βιομηχανία τροφίμων.