Development of circular bioprocesses and biorefineries for the production and biological recycling of poly(3-hydroxybutyrate)

Abstract

This PhD thesis focuses on the development of integrated biorefineries and recycling strategies for the sustainable production of poly(3-hydroxybutyrate) (PHB). The research explores two complementary pathways: (i) the valorisation of brewers’ spent grain (BSG) through sequential fractionation and microbial fermentation for PHB production and (ii) the enzymatic and thermochemical depolymerization of bioplastics followed by the subsequent utilization of hydrolysates for circular production of new PHB. By integrating biorefinery processes with closed-loop recycling concepts, this work establishes a holistic circular strategy for the sustainable and resource-efficient production of PHB, highlighting its potential to replace fossil-based plastics in a climate-neutral materials framework. Alternative refining schemes of BSG were systematically evaluated to identify the most efficient integrated process combining protein extraction and PHB production. The optimal biorefinery configuration involved the sequential aqueous extraction of dextrins, acidic proteolysis for protein recovery and subsequent dilute nitric-acid pretreatment of the residual solids prior to enzymatic hydrolysis. This combined strategy maximized the overall recovery of value-added components, enabling efficient nutrient valorisation and high fermentable sugar yields. The enzymatic hydrolysis of the pretreated solids achieved 84.5% glucan and 70.5% hemicellulose conversion yields. Fed-batch bioreactor cultivation of Paraburkholderia sacchari using the resulting hydrolysate produced 86.7 g/L PHB with 65.5% (w/w) intracellular content, 0.32 g/g yield and 2.7 g/(L·h) productivity. In the integrated BSG-based biorefinery scenario, 1 kg of raw BSG could be converted into approximately 160.2 g protein-rich extract and 155.1 g PHB, illustrating a highly efficient and sustainable cascade process that couples protein recovery with microbial biopolymer synthesis. A plasma bubble reactor using air as the feeding gas was employed to enhance PHB production from BSG facilitating also the cascade fractionation of protein and lignin as value-added co-products. Plasma operating parameters (voltage, pretreatment duration, duty cycle, initial solids concentration) were evaluated with the highest overall conversion yield of glucan and hemicellulose (73%, 0.494 gsugars/gBSG) achieved for initial solids concentration of 150 g/L. SEM analysis confirmed significant morphological disruption of fiber bundles and partial delignification compared to untreated BSG. The produced BSG hydrolysate led to higher PHB production efficiency (130 g/L total dry weight, 74.4 gPHB/L, 0.32 g/g yield, 2.64 g/(L·h) productivity) than conventional hydrolysates produced by enzymatic hydrolysis alone and enzymatic hydrolysis combined with hydrothermal treatment. The protein and lignin losses in the remaining BSG solids were 24.1% and 29.2% respectively. When renewable electricity is employed, the global warming potential was estimated at 0.59 kg CO2-eq per kgPHB and the abiotic depletion potential fossil at 11.12 MJ per kgPHB for PHB production based on plasma treated BSG. In the proposed biorefinery concept, 1 kg BSG could be converted into 147.6 g PHB with a solid fraction containing 137.4 g protein and 98.4 g lignin that could be subsequently fractionated as value-added co-products. This study demonstrated that BSG plasma treatment can be used for the exploitation of the full potential of BSG for the production of PHB with improved environmental impact and minimal losses of protein and lignin. This PhD thesis has also evaluated the thermochemical depolymerization of commercial bioplastics – including pure poly(3-hydroxybutyrate) powder (PHBP), PHB-based compounded pellets (PHBBCP) and poly(lactic acid) (PLA) – followed by bioconversion of the resulting monomers into PHB by Paraburkholderia sacchari and Cupriavidus necator. Hydrothermal hydrolysates of PHBP and PHBBCP at 200°C and 5–6 h treatment duration resulted in 72.9 – 74.0% 3-hydroxybutyric acid (3HB) and 21.9 – 27.1% crotonic acid (CA) content, whereas PLA fully degraded into lactic acid at 140°C. Alkaline treatment of PHBP and PHBBCP resulted in higher CA:3HB ratio (0.43 – 0.55) than hydrothermal treatment (0.20 – 0.39). Shake-flask fermentations using PHBP (2.2 gPHB/L by P. sacchari) or PLA (3.5 gPHB/L by C. necator) hydrothermal hydrolysates showed higher polymer production than PHBBCP hydrothermal and PHBP alkaline hydrolysates. Hydrothermal co-hydrolysates of PLA and PHBP reduced polymer production (ca. 1.4 g/L) by both strains. Benchmark shake flask fermentations using succinic acid and 1,4-butanediol – representative monomers of poly(butylene succinate) – showed that P. sacchari efficiently converted succinic acid to PHB (2.1 g/L), whereas 1,4-butanediol led to low bacterial growth and polymer formation. Bioreactor fed-batch fermentations with P. sacchari showed that a pH-stat feeding strategy with a concentrated hydrothermal PHBP hydrolysate led to 8.2 gPHB/L (54.9% w/w intracellular content), 0.29 g/(L·h) productivity, 0.54 g/g yield and 356 kDa weight average molecular weight. Enzymatic depolymerization was established as a mild and selective recycling route for PHB samples, employing a recombinant PHB depolymerase from Schlegelella thermodepolymerans to hydrolyze pure and compounded PHB materials. Optimized conditions (60°C, pH 9, 30 mL/L enzyme loading) enabled up to 83.1% 3ΗΒ conversion yield when 50 g/L initial pure PHB powder (PHBP) concentration was used, while dilute nitric-acid pretreatment (0.1 – 0.5% HNO₃, 70°C and 90°C) significantly enhanced polymer accessibility and maintained high depolymerase activity achieving 3HB conversion yields of 88.6 – 90.1%. PHB-based blends showed slightly lower degradation efficiency (52.0%) and conversion yield (39.8%) at an initial solid concentration of 20 g/L, likely due to the interference of additives. Both degradation efficiency and conversion yield was significantly increased when HNO3 pretreatment of PHB-based blends was employed (ca. 87% and 17.5%, respectively). However, all enzymatic hydrolysates were consumed by Cupriavidus necator for the production of new PHB achieving up to 54.3% intracellular PHB accumulation, demonstrating an efficient and benign biological recycling pathway. This PhD thesis presents an integrated biorefinery and recycling approach for the sustainable production PHB in a circular manner. By coupling the valorisation of BSG with thermochemical and enzymatic recycling of post-consumer bioplastics, a closed-loop system was established for PHB synthesis and recovery. The developed processes demonstrate high conversion efficiencies and strong alignment with circular bioeconomy principles, supporting the transition towards sustainable and carbon-neutral polymer production.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώνεται στην ανάπτυξη ολοκληρωμένων βιοδιυλιστηρίων και στρατηγικών ανακύκλωσης για τη βιώσιμη παραγωγή πολυ(3-υδροξυβουτυρικού) εστέρα (PHB). Πιο συγκεκριμένα δύο συμπληρωματικές προσεγγίσεις εξετάζονται: (i) η αξιοποίηση του δευτερογενούς παραπροϊόντος των ζυθοποιείων (Brewers spent grains, BSG), μέσω διαδοχικής κλασματοποίησης και μικροβιακής ζύμωσης για την παραγωγή PHB, και (ii) η ενζυμική και θερμοχημική αποικοδόμηση βιοπλαστικών, ακολουθούμενη από τη χρήση των παραγόμενων υδρολυμάτων για την κυκλική σύνθεση νέου PHB. Με την ενσωμάτωση διεργασιών βιοδιύλισης σε συνδυασμό με κυκλικές διεργασίες ανακύκλωσης, η μελέτη αυτή θεμελιώνει μια ολοκληρωμένη κυκλική στρατηγική για τη βιώσιμη και αποδοτική παραγωγή PHB, αναδεικνύοντας το δυναμικό του να αντικαταστήσει τα πλαστικά που προέρχονται από ορυκτές πρώτες ύλες σε ένα κλιματικά ουδέτερο πλαίσιο υλικών. Εναλλακτικά σχήματα επεξεργασίας του BSG αξιολογήθηκαν συστηματικά με σκοπό τον εντοπισμό της πιο αποδοτικής ολοκληρωμένης διεργασίας που συνδυάζει την ανάκτηση πρωτεΐνης με την παραγωγή PHB. Το βέλτιστο βιοδιυλιστήριο περιλάμβανε τη διαδοχική υδατική εκχύλιση δεξτρινών, την όξινη πρωτεόλυση για την ανάκτηση πρωτεΐνης και στη συνέχεια την ήπια προεπεξεργασία των υπολειπόμενων στερεών με χρήση νιτρικού οξέος πριν από την ενζυμική υδρόλυση των υπολειπόμενων στερεών. Η στρατηγική αυτή μεγιστοποίησε τη συνολική ανάκτηση προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας, επιτυγχάνοντας αποτελεσματική αξιοποίηση θρεπτικών συστατικών και υψηλές αποδόσεις ζυμούμενων σακχάρων. Η ενζυμική υδρόλυση των προεπεξεργασμένων στερεών οδήγησε σε απόδοση μετατροπής 84,5% για τη γλυκάνη και 70,5% για την ημικυτταρίνη. Ημι-συνεχείς ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρα με χρήση του βακτηρικού στελέχους Paraburkholderia sacchari και του παραγόμενου υδρολύματος ως πηγή άνθρακα οδήγησε στην παραγωγή 86,7 g/L PHB με ενδοκυτταρικό περιεχόμενο 65,5% (w/w), 0,32 g/g απόδοση και 2,7 g/(L·h) παραγωγικότητα. Στο συγκεκριμένο σενάριο βιοδιυλιστηρίου βασισμένου σε BSG, 1 kg ακατέργαστου BSG μπόρεσε να μετατραπεί σε περίπου 160,2 g κλάσματος πλούσιο σε πρωτεΐνη και 155,1 g PHB, αποδεικνύοντας μια ιδιαίτερα αποδοτική και βιώσιμη διεργασία που συνδυάζει την ανάκτηση πρωτεΐνης με τη μικροβιακή σύνθεση βιοπολυμερών. Με σκοπό την περαιτέρω ενίσχυση παραγωγής PHB από BSG, η τεχνολογία μη-θερμικού πλάσματος με χρήση ατμοσφαιρικού αέρα ως αέριο τροφοδοσίας εφαρμόστηκε, διευκολύνοντας παράλληλα τη διαδοχική κλασματοποίηση πρωτεΐνης και λιγνίνης ως προϊόντα υψηλής προστιθέμενης αξίας. Οι παράμετροι λειτουργίας του πλάσματος (τάση, διάρκεια προεπεξεργασίας, κύκλος λειτουργίας, αρχική συγκέντρωση στερεών) αξιολογήθηκαν συστηματικά, με τη μέγιστη συνολική απόδοση μετατροπής γλυκάνης και ημικυτταρίνης (73%, 0,494 g σακχάρων/gBSG) να επιτυγχάνεται σε αρχική συγκέντρωση στερεών 150 g/L. Η ανάλυση SEM επιβεβαίωσε σημαντική μορφολογική αποδιοργάνωση των ινωδών δομών και μερική απολιγνινοποίηση σε σύγκριση με το ακατέργαστο BSG. Το παραγόμενο υδρόλυμα BSG οδήγησε σε αυξημένη αποδοτικότητα παραγωγής PHB (130 g/L συνολικό ξηρό βάρος, 74,4 gPHB/L, 0,32 g/g απόδοση, 2,64 g/(L·h) παραγωγικότητα) σε σχέση με τα συμβατικά υδρολύματα που προέκυψαν αποκλειστικά από ενζυμική υδρόλυση ή από συνδυασμό ενζυμικής υδρόλυσης και υδροθερμικής προεπεξεργασίας. Οι απώλειες πρωτεΐνης και λιγνίνης στα υπολειπόμενα στερεά του BSG ήταν 24,1% και 29,2%, αντίστοιχα. Όταν χρησιμοποιείται ανανεώσιμη ηλεκτρική ενέργεια, το δυναμικό υπερθέρμανσης του πλανήτη εκτιμήθηκε ίσο με 0,59 kg CO₂-eq ανά kg PHB και το δυναμικό εξάντλησης ορυκτών πόρων σε 11,12 MJ ανά kg PHB, για παραγωγή PHB βασισμένη σε BSG έπειτα απο προεπεξεργασία με πλάσμα. Στο προτεινόμενο σενάριο βιοδιυλιστηρίου, 1 kg BSG μπορεί να μετατραπεί σε 147,6 g PHB, ενώ το υπολειπόμενο στερεό κλάσμα περιέχει 137,4 g πρωτεΐνης και 98,4 g λιγνίνης, που μπορούν να κλασματοποιηθούν περαιτέρω ως προϊόντα υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η μελέτη αυτή απέδειξε ότι η επεξεργασία BSG με πλάσμα μπορεί να αξιοποιηθεί για την πλήρη αξιοποίηση του δυναμικού του BSG για την παραγωγή PHB, επιτυγχάνοντας βελτιωμένο περιβαλλοντικό αποτύπωμα και ελάχιστες απώλειες πρωτεΐνης και λιγνίνης. Η παρούσα διδακτορική διατριβή αξιολόγησε επίσης την θερμοχημική αποικοδόμηση εμπορικών βιοπλαστικών – συμπεριλαμβανομένης καθαρής σκόνης PHB (PHBP), διαφορετικών μιγμάτων πέλλετ με βάση το PHB (PHBBCP) και πολυγαλακτικό οξύ (polylactic acid), PLA) – ακολουθούμενη από τη βιομετατροπή των παραγόμενων μονομερών σε PHB με τη χρήση των βακτηριακών στελεχών Paraburkholderia sacchari και Cupriavidus necator. Τα υδροθερμικά υδρολύματα των PHBP και PHBBCP στους 200°C για 5 – 6 ώρες οδήγησαν σε παραγωγή υδρολύματος με 72,9 – 74,0% 3-υδροξυβουτυρικού οξέος (3HB) και 21,9 – 27,1% κροτονικού οξέος (CA), ενώ το PLA αποδομήθηκε πλήρως σε γαλακτικό οξύ στους 140°C. Η αλκαλική επεξεργασία των PHBP και PHBBCP παρήγαγε υψηλότερο λόγο CA:3HB (0,43 – 0,55) σε σύγκριση με την υδροθερμική επεξεργασία (0,20 – 0,39). Ασυνεχείς ζυμώσεις σε κωνικές φιάλες χρησιμοποιώντας υδροθερμικά υδρολύματα PHBP (2,2 g PHB/L από P. sacchari) ή PLA (3,5 g PHB/L από C. necator) έδειξαν υψηλότερη παραγωγή πολυμερούς σε σχέση με τα υδροθερμικά υδρολύματα PHBBCP και τα αλκαλικά υδρολύματα PHBP. Μίγμα υδροθερμικών υδρολυμάτων PLA και PHBP οδήγησαν σε μείωση της παραγωγής πολυμερούς (περίπου 1,4 g/L) και για τα δύο στελέχη. Επιπλέον, ζυμώσεις σε κωνικές φιάλες με χρήση ηλεκτρικού οξέος και 1,4-βουτανοδιόλης – αντιπροσωπευτικά μονομερή του ηλεκτρικού πολυβουτυλένιου – έδειξαν ότι το βακτηριακό στέλεχος P. sacchari μετέτρεψε αποτελεσματικά το ηλεκτρικό οξύ σε PHB (2,1 g/L), ενώ η 1,4-βουτανοδιόλη οδήγησε σε χαμηλή βακτηριακή ανάπτυξη και περιορισμένο σχηματισμό πολυμερούς. Ημι-συνεχείς ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρα με το βακτηριακό στέλεχος P. sacchari έδειξαν ότι η pH-stat στρατηγική τροφοδοσίας με συμπυκνωμένο υδροθερμικό υδρόλυμα PHBP οδήγησε σε παραγωγή 8,2 gPHB/L (54,9% w/w ενδοκυτταρική συσσώρευση), 0,29 g/(L·h) παραγωγικότητα, 0,54 g/g απόδοση και μέσο μοριακό βάρος 356 kDa.Η ενζυμική αποικοδόμηση δειγμάτων PHB καθιερώθηκε ως μια ήπια και εκλεκτική οδός ανακύκλωσης, χρησιμοποιώντας μια ανασυνδυασμένη PHB-αποπολυμεράση από Schlegelella thermodepolymerans για την υδρόλυση καθαρών και σύνθετων υλικών PHB. Οι βελτιστοποιημένες συνθήκες (60°C, pH 9, 30 mL/L δόση ενζύμου) επέτρεψαν απόδοση μετατροπής 3HB έως και 83,1% όταν χρησιμοποιήθηκε 50 g/L αρχική συγκέντρωση καθαρής σκόνης PHB (PHBP), ενώ η ήπια προεπεξεργασία με αραιό νιτρικό οξύ (0,1 – 0,5% HNO₃, 70°C και 90°C) βελτίωσε σημαντικά την προσβασιμότητα του πολυμερούς και διατήρησε υψηλή ενζυμική δραστικότητα, επιτυγχάνοντας αποδόσεις μετατροπής 3HB της τάξης του 88,6–90,1%. Τα μίγματα με βάση το PHB εμφάνισαν ελαφρώς χαμηλότερη αποδοτικότητα αποδόμησης (52,0 %) και απόδοση μετατροπής (39,8%) σε αρχική συγκέντρωση στερεών 20 g/L, πιθανότατα λόγω της παρουσίας των προσθέτων ουσιών. Και οι δύο παράμετροι αυξήθηκαν σημαντικά μετά την προεπεξεργασία των μιγμάτων με βάση το PHB με χρήση HNO₃, φτάνοντας περίπου το 87% και 17,5% αντίστοιχα. Όλα τα ενζυμικά υδρολύματα καταναλώθηκαν αποτελεσματικά από το βακτηριακό στέλεχος C. necator για την παραγωγή νέου PHB, επιτυγχάνοντας ενδοκυτταρική συσσώρευση έως 54,3%, αποδεικνύοντας έτσι μια αποδοτική και ήπια βιολογική οδό ανακύκλωσης. Η παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζει μια ολοκληρωμένη προσέγγιση βιοδιυλιστηρίου και ανακύκλωσης για τη βιώσιμη παραγωγή PHB με κυκλικό τρόπο. Με τον συνδυασμό της αξιοποίησης του BSG με τη θερμοχημική και ενζυμική ανακύκλωση χρησιμοποιημένων βιοπλαστικών, αναπτύχθηκε ένα κυκλικό σύστημα για τη σύνθεση και ανάκτηση PHB. Οι διεργασίες που αναπτύχθηκαν παρουσιάζουν υψηλές αποδόσεις μετατροπής και ισχυρή ενσαρμόνιση με τις αρχές της κυκλικής βιοοικονομίας, υποστηρίζοντας τη μετάβαση προς βιώσιμη και κλιματικά ουδέτερη παραγωγή πολυμερών.