Συγκριτικές μελέτες παραγωγής αποθησαυριστικών μεταβολιτών, μέσω καλλιέργειας αυτότροφων και ετερότροφων μικροοργανισμών σε βιομηχανικά παραπροϊόντα

Abstract

The Greek dairy industry is a cornerstone of the national economy, producing globally recognized and widely appreciated products. However, its by-products, such as cheese whey, possess a high organic and pollutant load, and their uncontrolled disposal results in a severe environmental footprint. The present dissertation study aimed to utilize tools of Microbial Biotechnology to develop an integrated whey-based biorefinery, capable of bioconverting this by-product into high value-added metabolites through microbial processes, in alignment with the principles of the circular economy and green sustainable development. To achieve this, secondary cheese whey (SCW) was used as a cultivation substrate for non-conventional and under-explored yeast strains, with the dual goal of bioproduct synthesis and waste remediation. Initially, the strains Cryptococcus albidus Y-6965, Cutaneotrichosporon curvatus YB-775, and Papiliotrema laurentii YB-3594 were cultivated in shake-flasks experiments using lactose or glucose (60 g/L) under different nitrogen conditions (initial ratios of C/N = 20, 80, 160 mol/mol). Nitrogen-rich media favored cell proliferation, yielding >20 g/L dry biomass highly enriched in polysaccharides (>40% w/w). In contrast, nitrogen limitation in lactose media halted the growth of C. albidus and C. curvatus without triggering lipid accumulation, whereas in glucose media both strains secreted mannitol. The P. laurentii YB-3594 strain remained active even under nitrogen starvation conditions, although with a longer cultivation period. Subsequently, the three aforementioned strains, along with Papiliotrema laurentii Y-2536, were cultivated in bioreactors using microfiltered SCW, without nutrient supplementation. All strains grew successfully; however, growth of C. albidus and C. curvatus stabilized once the available nitrogen was exhausted. The batch culture of P. laurentii Y-2536 produced a remarkably high concentration (22.7 g/L) of exopolysaccharides (EPS) with a productivity of 504 mg/L/h, the highest ever reported, while P. laurentii YB-3594 required semi-continuous feeding with concentrated lactose solution to induce EPS production (25.6 g/L – 207 mg/L/h). The cellular polysaccharides (cPS) were rich in β-glucans, whereas the EPS consisted mainly of galacto-xylo-mannans. The highest antioxidant activity was recorded in the cPS of P. laurentii YB-3594. All polysaccharide fractions were tested for their effects on the viability of two human cancer cell lines (Caco-2 and HT29-MTX). The cPS from C. albidus Y-6965, P. laurentii Y-2536, and P. laurentii YB-3594 exhibited cytotoxic activity against HT29-MTX cells, whereas the cPS of C. curvatus YB-775, the EPS of P. laurentii YB-3594, and the heat-treated tEPS of P. laurentii Y-2536 showed no cytotoxic effects, suggesting potential safe applications in food, feed, or cosmetics.In parallel, the highly oleaginous strain Cryptococcus curvatus ATCC 20509 was cultivated under three different strategies. In batch culture, it achieved high biomass productivity (1336 mg/L/h) and 33.4 g/L dry biomass, containing 20.9% (w/w) lipids. In fed-batch culture with concentrated SCW feeding, it produced balanced biomass rich in both lipids (32.1%) and polysaccharides (34.8%), yielding the highest lipid productivity (262 mg/L/h). In fed-batch culture with concentrated lactose solution feeding, it achieved the highest values ever reported – 94.9 g/L dry biomass and 52.5 g/L lipids (55% w/w). The wastewater from yeast culture (YCW) was then used as a substrate for the autotrophic cultivation of the microalgae Chlorella vulgaris CCAP 211/11B and Tetraselmis verrucosa f. rubens PLA1-2, yielding approximately 0.6 g/L dry biomass. This novel sequential process, combining yeast and microalgal cultivation in whey-based media, resulted in complete detoxification of the effluent, enabling the safe environmental discharge of a treated by-product that meets regulatory standards, thus closing the sustainable biorefinery loop.

Η Ελληνική τυροκομία αποτελεί πυλώνα της εγχώριας οικονομίας, με προϊόντα παγκόσμιας αναγνώρισης και ευρείας αποδοχής. Τα παραπροϊόντα της τυροκομικής πρακτικής, όπως είναι το τυρόγαλα, χαρακτηρίζονται από υψηλό οργανικό και άρα ρυπαντικό φορτίο, με την άκρατη και ανεξέλεγκτη απόρριψή τους να δημιουργεί σοβαρό περιβαλλοντικό αποτύπωμα. Η εκμετάλλευση των εργαλείων της Μικροβιακής Βιοτεχνολογίας για την ανάπτυξη ενός ολοκληρωμένου βιοδιυλιστηρίου αξιοποίησης του τυρογάλακτος, όπως επιδιώχθηκε στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, δύναται να οδηγήσει στη βιομετατροπή του παραπροϊόντος, εν τη παρουσία μικροοργανισμών, σε μεταβολίτες υψηλής προστιθέμενης αξίας, συμβαδίζοντας με τις αρχές που διέπουν την κυκλική οικονομία και την πράσινη αειφόρο ανάπτυξη. Με απώτερο στόχο την καλλιέργεια στο δευτερογενές τυρόγαλα και σκοπό την απορρύπανσή του, αρχικά, διερευνήθηκε η ικανότητα ανάπτυξης των μη συμβατικών και ελάχιστα μελετημένων στελεχών ζυμών Cryptococcus albidus Y-6965, Cutaneotrichosporon curvatus YB-775 και Papiliotrema laurentii YB-3594 σε εμπορικά υποστρώματα εμπεριέχοντα λακτόζη ή γλυκόζη (καλλιέργειες μάρτυρας) αρχικής συγκεντρώσεως 60 g/L, υπό διαφορετικές συνθήκες αζωτοπεριεκτικότητας (αρχική αναλογία C/N = 20, 80 και 160 mol/mol), σε φιάλες. Οι συνθήκες περίσσειας αζώτου ευνοήσαν την κυτταροπλασία, αποδίδοντας τιμές παραγωγής ξηρής βιομάζας άνω των 20 g/L, ιδιαίτερα πλούσιας σε πολυσακχαρίτες (>40%, w/w). Η στέρηση αζώτου στις καλλιέργειες σε λακτόζη, για τα πρώτα δύο στελέχη, οδήγησε σε τερματισμό της περαιτέρω ανάπτυξής τους και όχι σε δυνητική λιποσυσσώρευση, ενώ στα υποστρώματα γλυκόζης σε έκκριση μαννιτόλης στο υγρό μέσο της καλλιέργειας. Ανάλογος περιορισμός δεν παρατηρήθηκε στις καλλιέργειες πενίας αζώτου του P. laurentii YB-3594, οι οποίες όμως διήρκησαν σαφώς περισσότερο χρόνο σε σχέση με τις αντίστοιχες υπό υψηλή αζωτοπεριεκτικότητα. Επακόλουθα, τα τρία προαναφερθέντα στελέχη καθώς και το στέλεχος Papiliotrema laurentii Y-2536, καλλιεργήθηκαν σε βιοαντιδραστήρα, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το προεπεξεργασμένο (μικροδιηθημένο) δευτερογενές τυρόγαλα (SCW), χωρίς περαιτέρω προσθήκη θρεπτικών συστατικών. Τα τέσσερα στελέχη αναπτύχθηκαν επιτυχώς στο SCW, αν και μερικώς στις ασυνεχείς καλλιέργειες των C. albidus Y-6965 και C. curvatus YB-775, η αύξηση των οποίων σταθεροποιήθηκε με την εξάντληση του διαθέσιμου αζώτου. Η ασυνεχής καλλιέργεια του P. laurentii Y-2536 απέδωσε σημαντική παραγωγή (22,7 g/L) εξωπολυσακχαριτών (EPS), με παραγωγικότητα 504 mg/L/h – η υψηλότερη τιμή στη διεθνή βιβλιογραφία, ενώ στην περίπτωση του P. laurentii YB-3594 ήταν απαραίτητη η ημι-συνεχής τροφοδότηση με δόσεις πυκνού διαλύματος λακτόζης, για την επαγωγή του δευτερογενούς μεταβολισμού και την έκκριση EPS (25,6 g/L – 207 mg/L/h). Οι κυτταρικοί πολυσακχαρίτες (cPS) που ανακτήθηκαν από όλα τα στελέχη ήταν πλούσιοι σε β-γλυκάνες, ενώ οι EPS αποτελούνται από γαλακτοξυλομαννάνες. Η υψηλότερη αντιοξειδωτική ικανότητα παρουσιάστηκε από τους cPS του P. laurentii YB-3594. Όλα τα πολυσακχαριδικά κλάσματα εξετάστηκαν ως προς την επίδρασή τους στη βιωσιμότητα δύο ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών, ήτοι των Caco-2 και HT29-MTX. Οι cPS των στελεχών C. albidus Y-6965, P. laurentii Y-2536 και P. laurentii YB-3594 επέδειξαν κυτταροτοξική δραστηριότητα έναντι της καρκινικής κυτταρικής σειράς HT29-MTX, ενώ οι cPS του C. curvatus YB-775, οι EPS του P. laurentii YB-3594 και οι θερμικώς προεπεξεργασμένοι tEPS του P. laurentii Υ-2536 δεν επηρέασαν την κυτταρική βιωσιμότητα σε καμία εκ των δύο σειρών. Παράλληλα, το ιδιαίτερα ελαιογόνο στέλεχος Cryptococcus curvatus ATCC 20509, καλλιεργήθηκε υπό τρεις διαφορετικές στρατηγικές. Κατά την ασυνεχή καλλιέργεια στο προεπεξεργασμένο SCW παρουσίασε πολύ υψηλή παραγωγικότητα βιομάζας (1336 mg/L/h), παράγοντας ξηρή βιομάζα στα 33,4 g/L, με τη λιποσυσσώρευση να ανέρχεται στο 20,9% (w/w, επί ξηράς βιομάζας). Η ημι-συνεχής καλλιέργεια στο SCW υπό τροφοδοσία με δόσεις συμπυκνωμένου SCW απέδωσε ξηρή βιομάζα ισορροπημένη αναφορικά με την περιεκτικότητά της σε λιπίδια (32,1%, w/w) και πολυσακχαρίτες (34,8%, w/w) και την υψηλότερη παραγωγικότητα λιπιδίων (262 mg/L/h) μεταξύ των τριών πειραμάτων. Η ημι-συνεχής καλλιέργεια στο SCW υπό τροφοδοσία με δόσεις συμπυκνωμένου διαλύματος λακτόζης απέδωσε τις υψηλότερες βιβλιογραφικά καταγεγραμμένες τιμές παραγωγής ξηρής βιομάζας (94,9 g/L) και λιπιδίων (52,5 g/L – 55%, w/w, επί της ξηρής βιομάζας). Το εξαντληθέν υγρό παραπροϊόν της ασυνεχούς καλλιέργειας του C. curvatus 20509 στο SCW, αποκαλούμενο και ως ΥΠΚΖ στα πλαίσια της παρούσης, χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα για τις αυτότροφες καλλιέργειες των μικροφυκών Chlorella vulgaris CCAP 211/11B και Tetraselmis verrucosa f. rubens PLA1-2, αποδίδοντας περί τα 0,6 g/L ξηρής βιομάζας. Η διαδοχική αυτή καλλιέργεια μικροφυκών στο υγρό παραπροϊόν καλλιέργειας ζυμών σε SCW, που δεν έχει αναφερθεί στη διεθνή βιβλιογραφία κατά το παρελθόν, οδήγησε στην πλήρη απορρύπανση του ρεύματος, δίδοντας τη δυνατότητα για απόρριψη ενός υγρού παραπροϊόντος που πληροί τις περιβαλλοντικές προδιαγραφές, ολοκληρώνοντας έτσι τον αειφόρο κύκλο του βιοδιυλιστηρίου.