Genetic study of Parkinson's disease on the island of Crete

Abstract

Background: Parkinson’s disease (PD) is a complex neurodegenerative disorder with both genetic and environmental underpinnings. While several large – scale international initiatives have characterized genetic risk factors in diverse populations, data from island-based Mediterranean populations remain scarce. This thesis presents the first comprehensive genetic study of PD in Crete, a population with distinct demographic, geographical, and historical features from the Greek mainland that may have influenced genetic architecture. Objectives: We investigated the genetic landscape of PD in the island – based population of Crete by establishing the Cretan PD Cohort (CPDC) and creating a biobank to study the genetic particularities of the Cretan population, to make genotype-phenotype associations, and to enable current and future research initiatives and collaborations. Methods: Clinical information and DNA samples from PD patients and age - and sex - matched controls were collected during a four-year period (2020 – 2024) from the Cretan population. Samples were analyzed using a combination of methods, including a genotyping array (NeuroBooster Array version 1.0) for both patients and controls, targeted screening for the GBA1 variants p.N409S and p.L483P for the patient cohort via PCR (polymerase chain reaction) – based methods, and whole exome sequencing (WES) in selected patients who were suspected for genetic PD (early - onset or/ and familial PD cases). Detected variants were classified according to well-established criteria (American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG). Results: DNA samples from 360 index patients and 251 controls were included. A molecular diagnosis (heterozygous dominant/ homozygous recessive pathogenic/likely pathogenic non-GBA1 variant) was identified in 3.1% of patients, including LRRK2 - PD (n = 4) and SNCA - PD (n = 1). A novel homozygous PINK1 variant (p.Y295Ter) and a rare homozygous FIG4 variant (p.I41T) were detected in two early-onset cases and other characteristics of recessive PD (e.g., dystonia). About 10.3% of patients carried a GBA1 variant, including four rare variants (p.C55S, p.H294Q, p.K237T, p.R502H), and had an adjusted earlier disease onset of 7.3 years (95% Confidence Intervals: -10.8 to -3.8, p < 0.0001). Additionally, GBA1 carriers had a 4.3-fold higher risk for PD compared to non-carriers (Odds Ratio, OR = 4.29, 95% CI: 1.61 – 14.8, p = 0.008). Discussion: These findings highlight the distinct genetic profile of PD in the Cretan population and support the use of targeted genetic testing and counseling. Given the growing relevance of GBA1 - and LRRK2 - specific findings in clinical trials and emerging therapies, these insights are of paramount clinical importance.

Εισαγωγή: Η νόσος του Πάρκινσον είναι μία σύνθετη, προοδευτική νευροεκφυλιστική διαταραχή. Πρόκειται για τη δεύτερη συχνότερη νευροεκφυλιστική νόσο και την πρώτη συχνότερη νευρολογική νόσο σε ρυθμό αύξησης της συχνότητάς της παγκοσμίως. Αν και η πλειονότητα των περιστατικών θεωρούνται σποραδικά, περίπου 10 – 15% των ασθενών αναφέρουν θετικό οικογενειακό ιστορικό (οικογενής νόσος του Πάρκινσον). Τα τελευταία χρόνια έχει αποκαλυφθεί η σημαντική συνεισφορά των γενετικών παραμέτρων στην εκδήλωση της νόσου, αλλά και στα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά της, κι έχει αναγνωριστεί πληθώρα γενετικών παραλλαγών (variants) που αυξάνουν τον κίνδυνο εμφάνισής της. Για κάποιες γενετικές παραλλαγές, οι οποίες απαντώνται σε ασθενείς με φαινομενικά σποραδική νόσο του Πάρκινσον, ο κίνδυνος αυτός είναι χαμηλός. Αυξάνεται, ωστόσο, όταν πολλές τέτοιες γενετικές παραλλαγές συνυπάρχουν και δρουν συνδυαστικά. Άλλες γενετικές παραλλαγές αυξάνουν σημαντικά τον κίνδυνο νόσησης σε σημείο που να συνδέονται αιτιολογικά με τη νόσο του Πάρκινσον και να κληρονομούνται με ένα από τα γνωστά πρότυπα μενδελιανής κληρονομικότητας (κληρονομικές ή γενετικές μορφές της νόσου του Πάρκινσον, αυτοσωμική ή υπολειπόμενη κληρονομικότητα). Οι συμπτωματικοί και ασυμπτωματικοί φορείς αναγνωρισμένων αιτιολογικών γενετικών παραλλαγών μπορούν να προσφέρουν πολύτιμες πληροφορίες για τη στοχευμένη μελέτη των υποκείμενων μεταβολικών μονοπατιών της νόσου του Πάρκινσον, καθώς και των κλινικών εκδηλώσεων των γενετικών της μορφών, ήδη από τα πολύ πρώιμα στάδια της νόσου. Απώτερος στόχος είναι η παροχή πληροφοριών που θα συνδράμουν στην κατανόηση εκείνων των μηχανισμών που εμπλέκονται στις σποραδικές, και πιο κοινές, μορφές της νόσου. Παράλληλα, οι ασυμπτωματικοί φορείς αποτελούν την ιδανική ομάδα όπου θα μπορούσαν να βρουν εφαρμογή θεραπείες ιατρικής ακριβείας, η ανάπτυξη των οποίων βρίσκεται ήδη σε εξέλιξη. Λόγω της εκτενούς ετερογένειας της νόσου του Πάρκινσον ως προς τις, κατ’ αρχάς, κλινικές της συνιστώσες (ηλικία έναρξης, πρόοδος νόσου, απάντηση στη θεραπεία, ειδικά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά) πολυάριθμες διεθνείς ερευνητικές πρωτοβουλίες έχουν διερευνήσει τους γενετικούς παράγοντες κινδύνου σε διαφορετικούς υποπληθυσμούς. Ωστόσο, τα δεδομένα από νησιωτικούς πληθυσμούς της Μεσογείου, μία περιοχή στο μεταίχμιο τριών ηπείρων, παραμένουν περιορισμένα. Η παρούσα διατριβή παρουσιάζει την πρώτη ολοκληρωμένη γενετική μελέτη της νόσου του Πάρκινσον στην Κρήτη, το μεγαλύτερο νησί στην Ελλάδα και το πέμπτο μεγαλύτερο στη Μεσόγειο. Θεωρούμε ότι ο πληθυσμός της Κρήτης παρουσιάζει ιδιαίτερο ερευνητικό ενδιαφέρον λόγω των δημογραφικών, γεωγραφικών και ιστορικών του χαρακτηριστικών, τα οποία ενδέχεται να έχουν επηρεάσει τη γενετική του αρχιτεκτονική. Ειδικότερα, οι νησιωτικοί πληθυσμοί, συμπεριλαμβανομένης της Κρήτης, θεωρείται ότι φέρουν χαρακτηριστικά «κλειστών» και «γενετικά απομονωμένων» πληθυσμών με μεγαλύτερη ομοιομορφία ως προς τους γενετικούς, αλλά και τους περιβαλλοντικούς παράγοντες έκθεσης. Οι πληθυσμοί αυτοί ευνοούν τον εντοπισμό σπάνιων ή υπολειπόμενων γενετικών παραλλαγών, ακόμη και όταν ο αριθμός των ασθενών είναι μικρός. Συνιστούν, επομένως, μια «δεξαμενή» γενετικών παραγόντων, οι οποίοι παραμένουν κι εμπλουτίζονται διαρκώς, καθώς μεταβιβάζονται από γενιά σε γενιά. Πρόσφατα επιδημιολογικά δεδομένα αποκαλύπτουν ότι ο επιπολασμός της νόσου του Πάρκινσον στην Κρήτη είναι 311 (95% Confidence Intervals, CI: 298 – 325) ανά 100,000 πληθυσμού. Ο δείκτης αυτός είναι ο χαμηλότερος στην Ελλάδα μετά την περιοχή των νησιών του Νοτίου Αιγαίου και είναι σχεδόν ο μισός από άλλες περιοχές της Ελλάδας, όπως η Θεσσαλία, τα Ιόνια νησιά, και η Δυτική Ελλάδα, υποδηλώνοντας διαφορές στους προδιαθεσικούς παράγοντες εντός της ίδιας χώρας. Σκοποί: Στόχος της μελέτης μας ήταν η διερεύνηση του γενετικού υπόβαθρου της νόσου του Πάρκινσον στον πληθυσμό της Κρήτης μέσω της δημιουργίας μίας ενιαίας κλινικής βάσης (Cretan Parkinson’s Disease Cohort, CPDC) και μίας σχετικής βιοτράπεζας. Πιο συγκεκριμένα, επιδιώξαμε τη μελέτη των γενετικών ιδιαιτεροτήτων της νόσου του Πάρκινσον στον Κρητικό πληθυσμό, τη διερεύνηση συσχετίσεων γονοτύπου – φαινοτύπου σε ασθενείς με νόσο του Πάρκινσον, καθώς και την ανάπτυξη μίας βάσης κλινικών και γενετικών δεδομένων που θα υποστηρίξει τρέχουσες και μελλοντικές ερευνητικές πρωτοβουλίες και συνεργασίες. Μέθοδοι: Κλινικές πληροφορίες και δείγματα ολικού αίματος ασθενών με νόσο του Πάρκινσον και υγειών μαρτύρων από τον ίδιο πληθυσμό συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της τετραετούς περιόδου 2020 έως 2024. Η στρατολόγηση των ασθενών διενεργήθηκε από το Εξωτερικό Ιατρείο Κινητικών Διαταραχών του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Ηρακλείου (ΠΑΓΝΗ). Οι κλινικές πληροφορίες περιλαμβάνουν δημογραφικά στοιχεία, πληροφορίες για το ιατρικό και οικογενειακό ιστορικό των ασθενών (συμπεριλαμβανομένης της κατασκευής του γενεαλογικού δέντρου σε βάθος τριών γενεών, όπου ήταν δυνατό), καθώς και πληροφορίες για τη νόσο του Πάρκινσον (ηλικία έναρξης, κλινική καταγραφή της νόσου). Πραγματοποιήθηκε απομόνωση γενετικού υλικού (DNA) στο εργαστήριο Νευρολογίας του Πανεπιστημίου Κρήτης. Στη συνέχεια τα δείγματα αναλύθηκαν με ένα συνδυασμό γενετικών μεθόδων ανίχνευσης, που περιλαμβάνουν τα εξής: α) γονοτύπιση όλων των ασθενών και των μαρτύρων με τη χρήση του NeuroBooster Array (version 1.0) [τα δείγματα των ασθενών που συλλέχθηκαν ως το Μάιο του 2023 απεστάλησαν για ανάλυση στο Εργαστήριο Νευρογενετικής του NIH (National Institutes of Health), ενώ τα δείγματα των ασθενών που συλλέχθηκαν από το Μάιο του 2023 έως το 2024, καθώς και όλα τα δείγματα των μαρτύρων απεστάλησαν στο συνεργαζόμενο εργαστήριο του Global Parkinson’s Genetics Program (GP2)], β) στοχευμένο έλεγχο για τις παραλλαγές p.N409S και p.L483P του γονιδίου GBA1 στο σύνολο των ασθενών μέσω μεθόδων PCR (Polymerase Chain Reaction, Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης) που πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Νευρολογίας του Πανεπιστημίου Κρήτης, και γ) αλληλούχηση των εξονίων του γονιδιώματος (WES, whole exome sequencing) σε επιλεγμένους ασθενείς με υποψία γενετικής μορφής της νόσου (πρώιμης έναρξης ή/ και οικογενής νόσος), που πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του εθνικού προγράμματος ΕΔΙΑΝ (Εθνικό Δίκτυο Ιατρικής Ακρίβειας για τα Νευροεκφυλιστικά Νοσήματα). Μελετήθηκαν γενετικές παραλλαγές σε 29 γονίδια που επιλέχθηκαν ως σχετιζόμενα με τη νόσο του Πάρκινσον μετά από ανασκόπηση της βιβλιογραφίας. Οι γενετικές παραλλαγές που εντοπίστηκαν ταξινομήθηκαν σύμφωνα με τα διεθνώς καθιερωμένα κριτήρια του American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG). Πραγματοποιήθηκαν συγκρίσεις μεταξύ υποομάδων ασθενών ή ασθενών – μαρτύρων με παραμετρικές και μη παραμετρικές μεθόδους στατιστικής ανάλυσης, καθώς και με τη χρήση μοντέλων ανάλυσης παλινδρόμησης (regression analyses). Αποτελέσματα: Συνολικά συμπεριλήφθηκαν δείγματα από 360 ασθενείς (index cases) και 251 μάρτυρες, αντιστοιχισμένους ως προς το φύλο και την ηλικία κατά την περίοδο ένταξης στη μελέτη. Δεδομένα WES ήταν διαθέσιμα για 43 από αυτούς τους ασθενείς. Ανιχνεύτηκαν συνολικά 32 παθογόνες ή πιθανά παθογόνες γενετικές παραλλαγές και 75 γενετικές παραλλαγές αμφίβολης σημασίας (variants of uncertain significance, VUS). Μοριακή διάγνωση, δηλαδή παρουσία ετερόζυγης επικρατούσας ή ομόζυγης υπολειπόμενης παθογόνου ή πιθανά παθογόνου παραλλαγής σε κάποιο από τα παραπάνω γονίδια (εκτός του GBA1) εντοπίστηκε στο 3.1% των ασθενών, περιλαμβάνοντας περιπτώσεις γενετικών παραλλαγών στα γονίδια LRRK2 (n = 4) και SNCA (n = 1). Επιπλέον, ταυτοποιήθηκε μία νέα γενετική παραλλαγή του γονιδίου PINK1 (p.Y295Ter) μέσω WES, και μία σπάνια γενετική παραλλαγή του γονιδίου FIG4 (p.I41T) σε ομόζυγη κατάσταση σε δύο ασθενείς με κλινικά χαρακτηριστικά που απαντώνται σε υπολειπόμενες μορφές της νόσου του Πάρκινσον (πρώιμη έναρξη, δυστονία, μακρά πορεία νόσου). Περίπου 10.3% των ασθενών (n = 37) έφεραν παραλλαγές στο γονίδιο GBA1, συμπεριλαμβανομένων 11 ασθενών με την παραλλαγή p.L483P, δύο ασθενών με την παραλλαγή p.N409S, οχτώ ασθενών με την παραλλαγή p.E365K και τεσσάρων με την παραλλαγή p.T408M, ενώ εντοπίστηκαν και τέσσερεις σπάνιες γενετικές παραλλαγές του GBA1 (p.C55S, p.H294Q, p.K237T, p.R502H). Οι ασθενείς αυτοί παρουσίασαν πρωιμότερη ηλικία έναρξης της νόσου κατά περίπου 7.3 χρόνια (95% Confidence Intervals, CI: 3.8 - 10.8, p < 0.0001). Επιπρόσθετα, οι φορείς GBA1 παραλλαγών εμφάνισαν 4.3 φορές υψηλότερο κίνδυνο εκδήλωσης της νόσου του Πάρκινσον σε σύγκριση με τους μη φορείς (Odds Ratio, OR = 4.29, 95% CI: 1.61 – 14.8, p = 0.008). Συζήτηση: Τα ευρήματα αυτά αναδεικνύουν το ιδιαίτερο γενετικό προφίλ της νόσου του Πάρκινσον στον Κρητικό πληθυσμό και υποστηρίζουν τη σημασία της στοχευμένης γενετικής διερεύνησης και γενετικής συμβουλευτικής. Δεδομένης της αυξανόμενης κλινικής σημασίας των ευρημάτων που σχετίζονται με τα γονίδια GBA1 και LRRRK2 σε κλινικές δοκιμές και αναδυόμενες θεραπείες, τα αποτελέσματα αυτά διαθέτουν ιδιαίτερη κλινική κι ερευνητική αξία.