Microbial community functioning at hypoxic sediments revealed by targeted metagenomics and RNA stable isotope probing

Abstract

Microorganisms are instrumental to the structure and functioning of marine ecosystems and to the chemistry of the ocean due to their essential part in the cycling of the elements and in the recycling of the organic matter. Two of the most critical ocean biogeochemical cycles are those of nitrogen and sulfur, since they can influence the synthesis of nucleic acids and proteins, primary productivity and microbial community structure. Oxygen concentration in marine environments is one of the environmental variables that have been largely affected by anthropogenic activities; its decline induces hypoxic events which affect benthic organisms and fisheries. Hypoxia has been traditionally defined based on the level of oxygen below which most animal life cannot be sustained. Hypoxic conditions impact microbial composition and activity since anaerobic reactions and pathways are favoured, at the expense of the aerobic ones. Naturally occurring hypoxia can be found in areas where water circulation is restricted, such as coastal lagoons, and in areas where oxygen-depleted water is driven into the continental shelf, i.e. coastal upwelling regions. Coastal lagoons are highly dynamic aquatic systems, particularly vulnerable to human activities and susceptible to changes induced by natural events. For the purpose of this PhD project, the lagoonal complex of Amvrakikos Gulf, one of the largest semi-enclosed gulfs in the Mediterranean Sea, was chosen as a study site. Coastal upwelling regions are another type of environment limited in oxygen, where also formation of oxygen minimum zones (OMZs) has been reported. Sediment in upwelling regions is rich in organic matter and bottom water is often depleted of oxygen because of intense heterotrophic respiration. For the purpose of this PhD project, the chosen coastal upwelling system was the Benguela system off Namibia, situated along the coast of south western Africa.The aim of this PhD project was to study the microbial community assemblages of hypoxic ecosystems and to identify a potential link between their identity and function, with a particular emphasis on the microorganisms involved in the nitrogen and sulfur cycles. The methodology that was applied included targeted metagenomics and RNA stable isotope probing (SIP). It has been shown that the microbial community diversity pattern can be differentiated based on habitat type, i.e. between riverine, lagoonal and marine environments. Moreover, the studied habitats were functionally distinctive. Apart from salinity, which was the abiotic variable best correlated with the microbial community pattern, oxygen concentration was highly correlated with the predicted metabolic pattern of the microbial communities. In addition, when the total number of Operational Taxonomic Units (OTUs) was taken into consideration, a negative linear relationship with salinity was identified (see Chapter 2). Microbial community diversity patterns can also be differentiated based on the lagoon under study since each lagoon hosts a different sulfate-reducing microbial (SRM) community, again highly correlated with salinity. Moreover, the majority of environmental terms that characterized the SRM communities were classified to the marine biome, but terms belonging to the freshwater or brackish biomes were also found in stations were a freshwater effect was more evident (see Chapter 3). Taxonomic groups that were expected to be thriving in the sediments of the Benguela coastal upwelling system were absent or present but in very low abundances. Epsilonproteobacteria dominated the anaerobic assimilation of acetate as confirmed by their isotopic enrichment in the SIP experiments. Enhancement of known sulfate-reducers was not achieved under sulfate addition, possibly due to competition for electron donors among nitrate-reducers and sulfate-reducers, to the inability of certain sulfate-reducing bacteria to use acetate as electron donor or to the short duration of the incubations (see Chapter 4). Future research should focus more on the community functioning of such habitats; an increased understanding of the biogeochemical cycles that characterize these hypoxic ecosystems will perhaps allow for predictions regarding the intensity and direction of the cycling of elements, especially of nitrogen and sulfur given their biological importance. Regulation of hypoxic episodes will aid the end-users of these ecosystems to possibly achieve higher productivity, in terms of fish catches, which otherwise is largely compromised by the elevated hydrogen sulfide concentrations.

Οι μικροοργανισμοί συμβάλλουν στη δομή και λειτουργία των θαλάσσιων οικοσυστημάτων και στη χημεία του ωκεανού λόγω του ουσιαστικού τους ρόλου στους κύκλους των χημικών στοιχείων και στην ανακύκλωση της οργανικής ύλης. Δύο από τους πιο σημαντικούς θαλάσσιους βιογεωχημικούς κύκλους είναι αυτοί του αζώτου και του θείου, καθώς μπορούν να επηρεάσουν τη σύνθεση των νουκλεϊκών οξέων και πρωτεϊνών, την πρωτογενή παραγωγικότητα και τη δομή της μικροβιακής κοινότητας. Η συγκέντρωση του οξυγόνου στα θαλάσσια περιβάλλοντα είναι μία από τις περιβαλλοντικές μεταβλητές που έχουν επηρεαστεί σε μεγάλο βαθμό από τις ανθρωπογενείς δραστηριότητες. Η μείωση του οξυγόνου προκαλεί υποξικά φαινόμενα που επηρεάζουν τους βενθικούς οργανισμούς και την αλιεία. Η υποξία έχει παραδοσιακά οριστεί με βάση το επίπεδο οξυγόνου κάτω από το οποίο δε μπορεί να διατηρηθεί η ζωή των μακροπανιδικών οργανισμών. Οι υποξικές συνθήκες επηρεάζουν τη σύνθεση και δραστηριότητα της μικροβιακής κοινότητας, εφόσον ευνοούνται αναερόβιες αντιδράσεις και οδοί, σε βάρος των αερόβιων. Η φυσική υποξία μπορεί να παρατηρηθεί σε περιοχές όπου υπάρχει περιορισμός στην κυκλοφορία του νερού, όπως οι παράκτιες λιμνοθάλασσες, και σε περιοχές όπου υδάτινες μάζες αποστερημένες από οξυγόνο οδηγούνται στην ηπειρωτική υφαλοκρηπίδα, δηλαδή σε περιοχές παράκτιων ανοδικών αναβλύσεων. Οι παράκτιες λιμνοθάλασσες είναι δυναμικά υδάτινα συστήματα, ιδιαίτερα ευάλωτα στις ανθρωπογενείς δραστηριότητες και ευαίσθητα στις αλλαγές που προκαλούνται από φυσικά φαινόμενα. Για το σκοπό της διδακτορικής διατριβής επιλέχθηκε ως περιοχή μελέτης το συγκρότημα λιμνοθαλασσών του Αμβρακικού κόλπου, ενός εκ των μεγαλύτερων ημί-κλειστων κόλπων της Μεσογείου. Οι περιοχές παράκτιων ανοδικών αναβλύσεων είναι ένας άλλος τύπος περιβάλλοντος με περιορισμένη συγκέντρωση οξυγόνου, όπου έχουν επίσης αναφερθεί σχηματισμοί ζωνών ελαχίστου οξυγόνου. Τα ιζήματα στις περιοχές ανοδικών αναβλύσεων είναι πλούσια σε οργανική ύλη και το νερό του πυθμένα είναι συχνά αποστερημένο από οξυγόνο εξαιτίας της έντονης ετερότροφης αναπνοής. Για το σκοπό της διδακτορικής διατριβής, η επιλεγμένη περιοχή παράκτιων ανοδικών αναβλύσεων ήταν το σύστημα της Μπενγκουέλα στη Ναμίμπια, που βρίσκεται κατά μήκος των ακτών της νοτιοδυτικής Αφρικής. Σκοπός αυτής της διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη των μικροβιακών συνευρέσεων των υποξικών οικοσυστημάτων και ο εντοπισμός μιας πιθανής σχέσης μεταξύ της ταυτότητας και της λειτουργίας τους, με ιδιαίτερη έμφαση στους μικροοργανισμούς που εμπλέκονται στους κύκλους του αζώτου και του θείου. Η μεθοδολογία που εφαρμόστηκε περιελάμβανε στοχευόμενη μεταγονιδιωματική και σήμανση του RNA με χρήση σταθερών ισοτόπων. Έχει δειχθεί ότι το πρότυπο ποικιλότητας της μικροβιακής κοινότητας μπορεί να διαφοροποιηθεί με βάση τον τύπο του οικοτόπου, δηλαδή μεταξύ ποταμιού, λιμνοθάλασσας και θαλάσσιου περιβάλλοντος. Επιπλέον, τα ενδιαιτήματα που μελετήθηκαν ήταν λειτουργικά διακριτά. Εκτός από την αλατότητα, η οποία ήταν η αβιοτική μεταβλητή που συσχετίζεται καλύτερα με το πρότυπο της μικροβιακής κοινότητας, η συγκέντρωση του οξυγόνου ήταν σε μεγάλο βαθμό συσχετισμένη με το προβλεπόμενο μεταβολικό πρότυπο των μικροβιακών κοινοτήτων. Επιπλέον, όταν ελήφθη υπόψη ο συνολικός αριθμός των λειτουργικών ταξινομικών μονάδων, εντοπίστηκε μια αρνητική γραμμική σχέση με την αλατότητα (βλ. Κεφάλαιο 2). Τα πρότυπα ποικιλότητας της μικροβιακής κοινότητας μπορούν επίσης να διαφοροποιηθούν με βάση τη λιμνοθάλασσα, δεδομένου ότι κάθε μία φιλοξενεί μια διαφορετική μικροβιακή ομάδα θειοαναγωγικών βακτηρίων, που επιπλέον συσχετίζεται σε μεγάλο βαθμό με την αλατότητα. Επιπλέον, οι περισσότεροι περιβαλλοντικοί όροι που χαρακτήρισαν τις κοινότητες των θειοαναγωγικών βακτηρίων ταξινομήθηκαν στο θαλάσσιο περιβάλλον, αλλά βρέθηκαν όροι που ανήκουν σε περιβάλλοντα γλυκού ή υφάλμυρου νερού στους σταθμούς όπου ήταν πιο εμφανής η επιρροή του γλυκού νερού (βλ. Κεφάλαιο 3). Οι ταξινομικές ομάδες που αναμενόταν να προσδιοριστούν στα ιζήματα της παράκτιας ανοδικής ανάβλυσης της Μπενγκουέλα απουσίαζαν ή υπήρχαν αλλά σε πολύ χαμηλές αφθονίες. Τα ε-πρωτεοβακτήρια κυριαρχούσαν στα πειράματα σήμανσης σταθερών ισοτόπων και ειδικότερα σε αυτά που περιελάμβαναν αναερόβια αφομοίωση οξικού οξέος, όπως επιβεβαιώνεται από τον ισοτοπικό εμπλουτισμό τους. Η ενίσχυση των γνωστών θειοαναγωγικών βακτηρίων δεν ήταν δυνατή υπό την προσθήκη θειικού άλατος, πιθανώς λόγω ανταγωνισμού για δότες ηλεκτρονίων μεταξύ θειοαναγωγικών και νιτροαναγωγικών βακτηρίων, στην αδυναμία ορισμένων θειοαναγωγικών βακτηρίων να χρησιμοποιούν οξικό οξύ ως δότη ηλεκτρονίων ή στη σύντομη διάρκεια των πειραμάτων (βλ. Κεφάλαιο 4). Η μελλοντική έρευνα πρέπει να επικεντρωθεί περισσότερο στη λειτουργία των μικροβιακών κοινοτήτων τέτοιων οικοτόπων. Η ενισχυμένη κατανόηση των βιογεωχημικών κύκλων που χαρακτηρίζουν αυτά τα υποξικά οικοσυστήματα θα επιτρέψει πιθανώς προβλέψεις σχετικά με την ένταση και την κατεύθυνση των κύκλων των στοιχείων, ιδιαίτερα του αζώτου και του θείου, δεδομένης της βιολογικής τους σημασίας. Η ρύθμιση των υποξικών επεισοδίων θα βοηθήσει τους τελικούς χρήστες αυτών των οικοσυστημάτων να επιτύχουν πιθανότατα υψηλότερη παραγωγικότητα, όσον αφορά τα ιχθυαλιεύματα, τα οποία διαφορετικά βλάπτονται σε μεγάλο βαθμό από τις αυξημένες συγκεντρώσεις υδρόθειου.