An integrated "omics" approach to unravel the impact of root symbionts on tomato direct and indirect defenses against insect herbivores

Abstract

Plants and insect herbivores have been interacting for several hundred million years. During their co-evolution, they have both evolved strategies to overcome each other’s defense mechanisms. The evolutionary arms race between plants and insect herbivores has resulted in the development of a sophisticated defense system that allows plants to recognize herbivore attack and activate plant immune responses to ward off herbivores. Plants confront herbivores both directly and indirectly. Direct plant defenses include physical characteristics that protect plants against herbivores and the production of toxic and/or anti-nutritive compounds that either kill or retard the development of the herbivorous enemies. Indirect defenses include the emission of a blend of volatile compounds that specifically attract the natural enemies of the herbivores, or the provision of food rewards and shelter to enhance the effectiveness of natural enemies. However, in their complex environments, plants also form mutualistic relationships with beneficial soil microbes, such as the arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and plant growth-promoting fungi (PGPF). Beneficial microbes have been long studied for their positive impact on plant growth, nutrition and yield as well as for their plant protective effects against abiotic and biotic stress factors. Nevertheless, more studies involving a combination of transcriptomic and metabolomic approaches are required in order to understand better the mechanisms used by beneficial microbes to induce plant resistance against insect herbivores. In this Doctoral study, I investigated the impact of the beneficial root microbes Rhizophagus irregularis and Trichoderma harzianum on tomato direct and indirect defense responses against insect herbivores. I used a combination of metabolomic and transcriptomic approaches in order to unravel the molecular and chemical mechanisms that underlie microbe-induced resistance of tomato against herbivores. In Chapter 1 of this dissertation, I aimed to investigate the effect of the two beneficial microbes on the plant and insect metabolome. Moreover, I wanted to answer whether microbe-induced changes in the plant metabolome could cascade up on the metabolome of Manduca sexta larvae feeding on the leaves of microbe-inoculated plants. By setting up an insect bioassay, I studied the life cycle of M. sexta larvae reared on non-inoculated and microbe-inoculated plants. I observed that root inoculation of tomato with R. irregularis and T. harzianum impaired M. sexta larvae pupation and adult emergence. In order to explain this finding, I used an untargeted metabolomic approach to study: ⅰ) the metabolites accumulated in the leaves of microbe-inoculated plants, and ⅱ) the metabolites accumulated in the gut and fat body tissues of the M. sexta larvae fed upon microbe-inoculated plants. The levels of tomato secondary metabolites (α-tomatine, α-dehydrotomatine) were increased in the leaves of microbe-inoculated plants. In addition, carnitine-derived metabolites, compounds such as piperidine, octanoic acid and benzamide were higher accumulated in the M. sexta larvae tissues. Remarkably, the levels of α-tomatine were also higher in the gut and fat body tissues of M. sexta larvae reared on microbe-inoculated plants. Therefore, it was concluded that the beneficial microbes altered the metabolome of plants, enhanced the synthesis of defense-related compounds, and this effect cascaded up on the metabolome of the insects fed on microbe-inoculated plants, thereby impairing M. sexta physiology and life cycle. In Chapter 2 of this dissertation, I pursued an integrated -omics approach in order to address the impact of the two beneficial microbes on the transcriptomic and metabolomic response of tomato to M. sexta herbivory. Therefore, I used a high-throughput RNA sequencing and metabolomic analysis, followed by the combination of the two approaches. The transcriptomic analysis separated non-infested from herbivore-infested samples. Herbivory was correlated with the downregulation of genes involved in photosynthesis and the upregulation of genes involved in stress responses. In response to herbivory, genes involved in secondary metabolism were upregulated in T.harzianum-inoculated plants. In parallel, genes involved in stress-related responses were upregulated in R. irregularis-inoculated plants. The metabolomic analysis clearly separated non-infested from herbivore-infested samples as well. Interestingly, the integrative analysis, performed over herbivory samples, separated the samples based on the beneficial microbe used. The correlation network analysis, performed over the same dataset, resulted in the formation of two correlation sub-networks, Rhi-focused and Tri-focused, enriched in elements modulated by the presence of R. irregularis and T. harzianum, respectively. In Chapter 3 of this dissertation, I aimed to investigate the impact of the two beneficial microbes on the induction of indirect defenses in response to herbivory by Spodoptera exigua larvae. With this aim, I initially tested the attraction of the zoophytophagous predator Macrolophus pygmaeus towards non-inoculated and microbe-inoculated herbivore-infested plants. Furthermore, I analyzed the herbivore-induced volatiles emitted by non-inoculated and microbe-inoculated plants as well as the expression levels of genes involved in the synthesis of herbivore-induced volatiles. It was observed that among herbivore-infested plants, M. pygmaeus preferred the microbe-inoculated compared to the non-inoculated ones. In addition, inoculation with beneficial microbes had a marginal effect on the emission of specific terpenoids that might affect the choice of M. pygmaeus. However, the gene expression analysis showed that the interaction effect between herbivory and beneficial microbes significantly affected the expression levels of only one marker gene. In conclusion, the results presented in this PhD study indicate that the beneficial root microbes R. irregularis and T. harzianum mediate plant-insect interactions and can trigger important effects over the three trophic levels: the plant, its herbivores, and their natural enemies. Thus, these findings strengthen the potential of beneficial root fungi to be used in agriculture as a promising alternative tool to reduce the use of chemical insecticides, ensure crop productivity and food security, and protect human health as well as the environment.

Τα φυτά και τα φυτοφάγα έντομα αλληλεπιδρούν μεταξύ τους εδώ και αρκετές εκατοντάδες εκατομμύρια χρόνια. Κατά τη διάρκεια της συν-εξέλιξής τους, και οι δύο έχουν αναπτύξει στρατηγικές για να υπερνικήσει ο ένας τους αμυντικούς μηχανισμούς του άλλου. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα τα φυτά να αναπτύξουν ένα εξελιγμένο αμυντικό σύστημα, το οποίο τους επιτρέπει να αντιλαμβάνονται την επίθεση φυτοφάγων εντόμων και να ενεργοποιούν τις ανοσολογικές τους αποκρίσεις για να τα αποτρέψουν κατά τη διάρκεια αυτής. Τα φυτά αντιμετωπίζουν τα φυτοφάγα έντομα είτε μέσω άμεσων είτε μέσω έμμεσων μηχανισμών άμυνας. Οι άμεσοι μηχανισμοί άμυνας των φυτών περιλαμβάνουν φυσικά χαρακτηριστικά που τα προστατεύουν από τα φυτοφάγα έντομα, καθώς και την παραγωγή τοξικών και/ή αντι-θρεπτικών ενώσεων που είτε σκοτώνουν είτε επιβραδύνουν την ανάπτυξη των φυτοφάγων εχθρών. Οι έμμεσοι μηχανισμοί άμυνας περιλαμβάνουν την έκλυση ενός μίγματος πτητικών χημικών ενώσεων που προσελκύουν στοχευμένα τους φυσικούς εχθρούς των φυτοφάγων εντόμων, ή την παροχή τροφικών πόρων και καταφυγίου για την ενίσχυση της αποτελεσματικότητας των φυσικών εχθρών των φυτοφάγων εντόμων. Παρόλα αυτά, στα πολύπλοκα περιβάλλοντά τους, τα φυτά σχηματίζουν αμοιβαίες σχέσεις με ωφέλιμους μικροοργανισμούς του εδάφους, όπως οι μυκόρριζες και οι μύκητες που έχουν την ικανότητα να προάγουν της ανάπτυξη των φυτών. Οι ωφέλιμοι αυτοί μικροοργανισμοί έχουν μελετηθεί εκτενώς για τη θετική τους επίδραση στην ανάπτυξη, τη θρέψη και την απόδοση των φυτών, καθώς και για τις προστατευτικές τους ιδιότητες έναντι αβιοτικών και βιοτικών παραγόντων καταπόνησης των φυτών. Εντούτοις, απαιτούνται περισσότερες επιστημονικές μελέτες που να συνδυάζουν μεταγραφικές και μεταβολικές προσεγγίσεις, ώστε να κατανοηθούν καλύτερα οι μηχανισμοί μέσω των οποίων οι ωφέλιμοι μικροοργανισμοί επάγουν ανθεκτικότητα των φυτών απέναντι στα φυτοφάγα έντομα. Στο 1ο κεφάλαιο, της παρούσας διδακτορικής διατριβής, διερευνήθηκε η επίδραση των δύο ωφέλιμων μικροοργανισμών Rhizophagus irregularis και Trichoderma harzianum (οι οποίοι έχουν την ικανότητα να αποικίζουν τις ρίζες των φυτών) στις άμεσες και έμμεσες αμυντικές αποκρίσεις φυτών τομάτας έναντι φυτοφάγων εντόμων. Ένας συνδυασμός μεταβολωμικών και μεταγραφικών προσεγγίσεων χρησιμοποιήθηκε ούτως ώστε για να μελετηθούν οι μοριακοί και χημικοί μηχανισμοί που διέπουν τη μικροβιο-επαγόμενη ανθεκτικότητα των φυτών τομάτας απέναντι σε φυτοφάγα έντομα της τάξης των λεπιδόπτερων. Στόχος του παρόντος κεφαλαίου ήταν η διερεύνηση της επίδρασης των δύο ωφέλιμων μικροοργανισμών στο μεταβολωμικό προφίλ όχι μόνον του φυτού αλλά και του εντόμου. Επιπλέον, εξετάστηκε εάν οι μικροβιο-επαγόμενες αλλαγές στο μεταβολωμικό προφίλ του φυτού μπορούν να μεταφερθούν και να επηρεάσουν το μεταβολωμικό προφίλ των προνυμφών του εντόμου Manduca sexta που τρέφονται με φύλλα φυτών τομάτας εμβολιασμένων με μικροοργανισμούς. Μελετήθηκε ο κύκλος ζωής των προνυμφών της M. sexta που αναπτύχθηκαν σε μη εμβολιασμένα και εμβολιασμένα φυτά τομάτας. Παρατηρήθηκε ότι ο εμβολιασμός των ριζών της τομάτας με R. irregularis και T. harzianum επηρέασε αρνητικά την ωρίμανση και την εμφάνιση των ενηλίκων της M. sexta. Τα επίπεδα δευτερογενών μεταβολιτών των φυτών τομάτας (όπως η α-τοματίνη και η α-δεϋδροτοματίνη) ήταν αυξημένα στα φύλλα των εμβολιασμένων φυτών. Επιπλέον, μεταβολίτες που σχετίζονται με την καρνιτίνη, όπως πιπεριδίνη, οκτανοϊκό οξύ και βενζαμίδιο, συσσωρεύτηκαν σε υψηλότερα επίπεδα στους ιστούς των προνυμφών που ετράφησαν σε αυτά τα φυτά. Τα επίπεδα της α-τοματίνης ήταν επίσης αυξημένα στο έντερο και στους λιπώδεις ιστούς των προνυμφών που αναπτύχθηκαν σε εμβολιασμένα φυτά. Ως εκ τούτου, από τη μελέτη που διεξήχθη στο 1ο κεφάλαιο της διδακτορικής αυτής διατριβής εξάγεται το συμπέρασμα ότι οι δύο ωφέλιμοι μικροοργανισμοί που χρησιμοποίηθηκαν τροποποίησαν το μεταβολωμικό προφίλ των φυτών τομάτας, ενίσχυσαν τη σύνθεση χημικών ενώσεων άμυνας στα φυτά αυτά και επιπλέον η επίδραση αυτή μεταφέρθηκε και στο μεταβολωμικό προφίλ των φυτοφάγων εντόμων επηρεάζοντας έτσι τη φυσιολογία και τον κύκλο ζωής τους. Στο 2ο κεφάλαιο αυτής της διδακτορικής διατριβής εφαρμόστηκε μια ολοκληρωμένη -ομική προσέγγιση για να διερευνηθεί η επίδραση των δύο ωφέλιμων μικροοργανισμών στη μεταγραφική και μεταβολική αμυντική απόκριση των φυτών τομάτας κατά την προσβολή από το λεπιδόπτερο φυτογάγο έντομο M. sexta. Η μεταγραφική ανάλυση διαχώρισε σαφώς τα μη προσβεβλημένα από τα προσβεβλημένα δείγματα φύλλων του φυτού. Η προσβολή από έντομα συσχετίστηκε με την καταστολή γονιδίων που εμπλέκονται στη φωτοσύνθεση και ταυτόχρονα με την ενεργοποίηση γονιδίων που σχετίζονται με αμυντικές αποκρίσεις σε περίπτωση καταπόνησης του φυτού. Στα φυτά που ήταν εμβολιασμένα με το μύκητα T. harzianum, τα γονίδια που σχετίζονται με δευτερογενή μεταβολισμό έδειξαν αυξημένο αριθμό μεταγράφων. Παράλληλα, στα φυτά εμβολιασμένα που ήταν εμβολιασμένα με τη μυκόρριζα R. irregularis, τα γονίδια που σχετίζονται με αποκρίσεις σε καταπονήσεις έδειξαν επίσης αυξημένο αριθμό μεταγράων. Επιπλέον, η μεταβολωμική ανάλυση οδήγησε σε σαφή διαχωρισμό των υγιών (μη προσβεβλημένων) από τα προσβεβλημένα φυτά. Η συνδυαστική -ομική ανάλυση διαχώρισε τα φυτικά δείγματα με βάση τον μικροοργανισμό. Το δίκτυο συσχετίσης αποκάλυψε δύο υπο-δίκτυα, το ένα επικεντρωμένο στη μυκόρριζα R. irregularis και το άλλο στο μύκητα T. harzianum. Στο 3ο κεφάλαιο αυτής της διδακτορικής διατριβής, στόχος ήταν η μελέτη της επίδρασης των δύο ωφέλιμων μικροοργανισμών στην επαγωγή των έμμεσων μηχανισμών αμυνας των φυτών τομάτας έναντι της προσβολής από προνύμφες του λεπιδόπτερου εντόμου Spodoptera exigua. Αρχικά, εξετάστηκε η έλξη του ζωοφυτοφάγου θηρευτή Macrolophus pygmaeus προς μη εμβολιασμένα και εμβολιασμένα προσβεβλημένα από έντομα φυτά. Επιπλέον, αναλύθηκαν οι χημικοί πτητικοί μεταβολίτες που εκλύονται μετά από προσβολή, καθώς και τα επίπεδα έκφρασης γονιδίων που εμπλέκονται στη σύνθεση αυτών των μεταβολιτών. Παρατηρήθηκε ότι, μεταξύ των προσβεβλημένων φυτών, ο M. pygmaeus προτιμούσε τα εμβολιασμένα με βελτιωτικούς μικροοργανισμούς. Ο εμβολιασμός είχε στατιστικά οριακή επίδραση στην έκλυση συγκεκριμένων τερπενοειδών που ενδέχεται να επηρεάζουν την επιλογή του θηρευτή. Ωστόσο, η ανάλυση γονιδιακής έκφρασης έδειξε ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ προσβολής και μικροοργανισμών επηρέασε σημαντικά την έκφραση μόνο ενός γονιδίου. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτής της διδακτορικής μελέτης δείχνουν ότι οι ωφέλιμοι ριζικοί μικροοργανισμοί R. irregularis και T. harzianum επηρεάζουν τις αλληλεπιδράσεις φυτών–εντόμων και μπορούν να επιφέρουν σημαντικές αλλαγές που εκτείνονται σε τρία τροφικά επίπεδα: το φυτό, τα φυτοφάγα έντομα που το προσβάλουν αλλά και στους φυσικούς εχθρούς αυτών των εντόμων. Τα ευρήματα αυτά ενισχύουν τη δυναμική των ωφέλιμων μυκήτων ως μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική λύση για τη μείωση της χρήσης χημικών εντομοκτόνων, τη διασφάλιση της παραγωγικότητας των καλλιεργειών και της επισιτιστικής ασφάλειας, καθώς και την προστασία της ανθρώπινης υγείας και του περιβάλλοντος.