Molecular mechanisms of free fatty acid activity in antifungal host defense

Abstract

In this Ph.D. thesis, we investigated the molecular mechanisms of free fatty acids (FFAs) inhibitory activity against Mucorales fungi. Mucorales are the causative agents of Mucormycosis, a devastating and emerging invasive fungal disease with unacceptably high mortality rates, exceeding 90% upon dissemination. Unlike other invasive fungal infections, Mucormycosis uniquely affects patients with metabolic abnormalities, especially diabetic ketoacidosis (DKA), suggesting that host metabolic factors play a critical role in immunity against Mucorales. In this work, we explored how host metabolism regulates immunity against Mucorales both extracellularly, in the serum, and intracellularly, within macrophages, with the ultimate goal of identifying host directed metabolic therapies against Mucormycosis. This Ph.D. thesis comprises two main projects.The first project focuses on the role of albumin–bound FFAs in inhibiting Mucorales growth and virulence. Our initial studies identified hypoalbuminemia as an independent risk factor for the development of Mucormycosis in clinical cohorts across different continents. Importantly, we found that serum albumin shuttles, solubilizes and delivers middle- and long-chain FFAs to Mucorales spores to inhibit fungal growth. Importantly, under conditions of hypoalbuminemia, FFAs in the serum undergo oxidation and lose their antifungal activity, as they can no longer efficiently enter Mucorales spores. These studies reveal a novel role of albumin in host defense against this class of pathogens. Mechanistically, we discovered that Mucorales are uniquely susceptible to the activity of host FFAs because their growth relies almost exclusively on aerobic glycolysis. Using biochemical analyses, RNA sequencing, functional metabolic assays, and live super resolution microscopy, we demonstrated that FFAs induce early mitochondrial damage within minutes of their uptake within the spores. FFA-induced mitochondrial dysfunction leads to redox imbalance, as damaged mitochondria fail to recycle NAD⁺, resulting in shutdown of glycolysis and fungal growth arrest. These findings establish fungal aerobic glycolysis as a viable therapeutic target against Mucormycosis.The second project examines the intracellular role of FFAs in macrophage immunity against Mucorales. We found that macrophages exploit the metabolic vulnerability of Mucorales by targeting the dependence of this fungal pathogen on aerobic glycolysis. Specifically, macrophages activate a novel immunometabolic pathway in which intracellular FFAs stored in lipid droplets (LDs) are delivered to Mucorales-containing phagosomes to restrict fungal growth. Following phagocytosis, Mucorales spores inhibit LC3-associated phagocytosis (LAP) and induce phagosome maturation arrest due to prolonged retention of melanin on their cell wall surface. Using electron microscopy and live-cell confocal imaging, we found that macrophages melanin-induced LAP blockade triggers a unique immunometabolic response that activates OXPHOS and redirects LDs to the fungal phagosome. This process requires Rab7, which relocates from its canonical role in lysosome–phagosome fusion to lipid droplets, facilitating their fusion with the Mucorales-containing phagosomes.In metabolic disorders such as DKA, nuclear stabilization of the macrophage metabolic master regulator HIF-1α induces mitochondrial dysfunction, inhibits OXPHOS and results in impaired LD targeting to phagosomes and invasive fungal growth. Genetic and pharmacological inhibition of HIF-1α restores oxidative phosphorylation, reactivates lipid targeting, and protects against Mucormycosis. Notably, experiments in Drosophila melanogaster model of Mucormycosis upon conditional inactivation of HIF-1α orthologue (sima) demonstrated that this immunometabolic pathway is evolutionarily conserved, underscoring its biological significance.In summary, this thesis reveals the fundamental role of metabolic competition between host and pathogen for the outcome of Mucorales infection. Mucorales rely on aerobic glycolysis to rapidly generate ATP and sustain their growth, whereas the host exploits this metabolic dependency by targeting fungal lipid homeostasis, inducing mitochondrial damage and suppressing glycolysis. These findings fundamentally redefine Mucormycosis as a metabolic disease, providing a mechanistic explanation for the unique and well-documented susceptibility of patients with diabetic ketoacidosis. Finally, this work highlights mitochondrial metabolism, both in the host and the pathogen, as a promising therapeutic target against this devastating infection.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε ο μοριακός μηχανισμός δράσης των φυσιολογικών λιπιδίων έναντι των μυκήτων του γένους Mucorales. Η μουκορμύκωση, νόσος που προκαλείται από τους μύκητες αυτούς, αποτελεί μια αναδυόμενη διηθητική μυκητίαση με εξαιρετικά υψηλά ποσοστά θνησιμότητας, τα οποία υπερβαίνουν το 90% σε περιπτώσεις γενικευμένης λοίμωξης. Σε αντίθεση με άλλες διηθητικές μυκητιάσεις, η μουκορμύκωση εμφανίζεται σχεδόν αποκλειστικά σε ασθενείς με μεταβολικές διαταραχές, γεγονός που υποδηλώνει την ύπαρξη φυσιολογικών μεταβολικών μηχανισμών άμυνας έναντι της νόσου.Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν ο χαρακτηρισμός των μηχανισμών μεταβολικής αλληλεπίδρασης των μυκήτων Mucorales με το φυσιολογικό περιβάλλον της λοίμωξης, προκειμένου να κατανοηθεί η παθογένεση της νόσου και να αναδειχθούν νέες θεραπευτικές προσεγγίσεις. Η διατριβή διαρθρώνεται σε δύο διακριτά μέρη.Στο πρώτο μέρος μελετήθηκε η ανασταλτική δράση των ελεύθερων λιπαρών οξέων που είναι προσδεδεμένα στην αλβουμίνη του ορού στην ανάπτυξη και στην έκφραση παραγόντων λοιμογόνου δύναμης των μυκήτων Mucorales. Μέσα από κλινικές μελέτες διαπιστώθηκε ότι η αλβουμίνη αποτελεί τον μοναδικό ανεξάρτητο παράγοντα κινδύνου για την ανάπτυξη της μουκορμύκωσης. Πειραματικά δεδομένα κατέδειξαν την άμεση αντιμυκητιακή δράση της αλβουμίνης, η οποία οφείλεται στην ικανότητά της να διαλυτοποιεί, να μεταφέρει και να καθιστά βιοδιαθέσιμα τα ελεύθερα λιπαρά οξέα που είναι προσδεδεμένα στο μόριο της. Τα λιπαρά αυτά οξέα εισέρχονται ενεργητικά στους μύκητες και, όταν συσσωρεύονται σε υψηλές συγκεντρώσεις, αναστέλλουν την ανάπτυξή τους. Επιπλέον, σε καταστάσεις υποαλβουμιναιμίας, τα λιπαρά οξέα οξειδώνονται και χάνουν την ικανότητά τους να εισέρχονται αποτελεσματικά στους μύκητες, ευνοώντας την ανάπτυξη του και αυξάνοντας τον κίνδυνο εμφάνισης της νόσου. Τα ευρήματα αυτά αποκαλύπτουν για έναν νέο ρόλο της αλβουμίνης στην άμυνα έναντι μιας ιδιαίτερης ομάδας μυκήτων απειλητικών για τον άνθρωπο.Ο ανασταλτικός μηχανισμός δράσης των φυσιολογικών λιπιδίων σχετίζεται με το γεγονός ότι οι μύκητες Mucorales βασίζονται κατά κύριο λόγο στην αερόβια γλυκόλυση για την παραγωγή ενέργειας. Μέσω βιοχημικών αναλύσεων, ανάλυσης μεταγραφώματος, λειτουργικών μεταβολικών πειραμάτων και μικροσκοπίας διαπιστώθηκε ότι τα φυσιολογικά λιπαρά οξέα του ξενιστή που εισέρχονται ενεργητικά στα κύτταρα του μύκητα προκαλούν ταχύτατα μιτοχονδριακή βλάβη, οδηγώντας σε αδυναμία ανακύκλωσης του NAD⁺, οξειδοαναγωγική ανισορροπία, και τελικά αναστολή της αερόβιας γλυκόλυσης. Κατά συνέπεια, η στόχευση αυτού του μεταβολικού μονοπατιού αναδεικνύεται ως μια καινοτόμος θεραπευτική προσέγγιση. Το δεύτερο μέρος της διατριβής επικεντρώθηκε στον ενδοκυττάριο ρόλο των φυσιολογικών λιπαρών οξέων στη ρύθμιση της αντιμυκητιακής ανοσίας έναντι των Mucorales. Τα μακροφάγα εκμεταλλεύονται τη μεταβολική ιδιαιτερότητα των μυκήτων, δηλαδή την αποκλειστική εξάρτησή τους από την αερόβια γλυκόλυση, προκειμένου να αναστείλουν την ανάπτυξή τους μετά τη φαγοκυττάρωση των σπορίων τους. Η διαδικασία αυτή βασίζεται στην ενεργοποίηση ενός ιδιαίτερου ανοσομεταβολικού μονοπατιού. Συγκεκριμένα, οι μύκητες Mucorales αναστέλλουν την ωρίμανση του φαγοσώματος λόγω της μελανίνης του κυτταρικού τους τοιχώματος. Μέσω ηλεκτρονικής και ζωντανής μικροσκοπίας διαπιστώθηκε ότι η αναστολή αυτή ενεργοποιεί τη μιτοχονδριακή λειτουργία των μακροφάγων, επιτρέποντας τη στοχευμένη μεταφορά των λιποσταγονιδίων (lipid droplets) προς τα φαγοσώματα που περιέχουν τους μύκητες, καταστέλλοντας την ανάπτυξή τους. Η διαδικασία αυτή απαιτεί τη μετατόπιση της μικρής GTPάσης Rab7 από τα ενδοσώματα/λυσοσώματα προς τα λιποσταγονίδια, διευκολύνοντας τη σύντηξή τους με τα φαγοσώματα.Σε καταστάσεις μεταβολικών διαταραχών, όπως η διαβητική κετοξέωση, λειτουργικά μεταβολικά πειράματα και αναλύσεις μικροσκοπίας έδειξαν ότι η σταθεροποίηση του μεταγραφικού παράγοντα HIF-1α οδηγεί σε μιτοχονδριακή δυσλειτουργία στα μακροφάγα, παρεμποδίζοντας τη στόχευση των λιποσταγονιδίων και επιτρέποντας τη διηθητική ανάπτυξη των μυκήτων. Η γενετική ή φαρμακευτική στόχευση του HIF-1α στα κυψελιδικά μακροφάγα αποκαθιστά την οξειδωτική φωσφορυλίωση, την αναστολή της ενδοκυττάριας ανάπτυξης των σπορίων του μύκητα και προστατεύει από τη μουκορμύκωση. Πειράματα σε μοντέλο Μουκορμύκωσης στη Drosophila melanogaster με εκλεκτική σίγαση του ομόλογου μεταγραφικού παράγοντα (Sima) στα φαγοκύτταρα κατέδειξαν την εξελικτική συντήρηση του μηχανισμού αυτού.Συνολικά, τα αποτελέσματα της διατριβής αναδεικνύουν τον μεταβολικό ανταγωνισμό μεταξύ παθογόνου και ξενιστή σε κεντρικό ρυθμιστή της έκβασης της λοίμωξης από μύκητες Mucorales. Ειδικότερα, ενώ το παθογόνο εκμεταλλεύεται την ταχεία παραγωγή ενέργειας μέσω της αερόβιας γλυκόλυσης για την ανάπτυξη του, ο ξενιστής στοχεύει μεταβολικά τα λιπίδια προς τον μύκητα, αναστέλλοντας την ανάπτυξή του. Τα ευρήματα αυτά επαναπροσδιορίζουν τη μουκορμύκωση ως μεταβολική νόσο και εξηγούν γιατί συνδέεται στενά με τη διαβητική κετοξέωση, ανοίγοντας τον δρόμο για νέες θεραπευτικές στρατηγικές που στοχεύουν τόσο τον μεταβολισμό του ξενιστή όσο και του παθογόνου.