The genetic basis of azoospermia

Abstract

Infertility is a global health issue affecting ~17.5% of adults, with male factorscontributing to approximately 50% of cases. Azoospermia, the complete absence ofsperm in ejaculate, is the most severe form of male infertility. This thesis provides an in-depth description of human spermatogenesis followed by a comprehensive introductionto azoospermia, including its types, prevalence, and current clinical managementpractices. A thorough review of the known genetic basis as well as the emerging geneticmarkers associated with non-obstructive azoospermia is provided with emphasis on theavailable data from GWAS and transcriptomic studies. A meta-analysis of 11,323 semen analyses records, extracted for the Embryolab FertilityClinic database, over an 18-year period (2008–2025) demonstrated a significant declinein normospermia (−1.76% per year) and a parallel rise in abnormal semen phenotypes,especially teratospermia (+3.35% per year). Azoospermia was found to be the only stablesperm phenotype with a mean prevalence at 7.35% across the study period. Additionally,clinical outcomes from 300 azoospermic men who underwent micro-TESE andsubsequent ICSI were analyzed. Sperm retrieval was successful in 89% of cases. Theclinical performance of the testicular spermatozoa was compared across the differenttesticular subgroups and between fresh and frozen spermatozoa. Higher fertilizationrates were recorded using fresh compared to frozen testicular spermatozoa andtesticular spermatozoa from tissues with high and average presence compared to rarepresence of spermatozoa. Pregnancy and delivery rates were comparable across allgroups. Focusing on azoospermia and severe oligozoospermia, a genome-wide associationstudy (GWAS) was conducted, involving 85 infertile and 280 fertile Greek men. The studyidentified seven novel SNPs associated with azoospermia and severe oligozoospermia. The seven SNPs identified were located within or near protein-coding genes (GRID2,SLC2A12, FBXW2, and CYP2C8) and long intergenic non-coding RNAs (LINC01756,SNHG14, and AC090457.1), suggesting diverse mechanisms, potentially contributing tospermatogenic failure. Functional annotation revealed that several of these variants mayinfluence gene expression through eQTL effects, particularly SGK1, a gene implicated inSertoli cell function and blood–testis barrier integrity. The transcriptomic study followed explored the expression profiles of 26 testiculartissues obtained from men diagnosed with idiopathic non-obstructive azoospermia(iNOA) and obstructive azoospermia (OA, controls), using bulk RNA sequencing. Comparative analysis revealed 3,858 differentially expressed protein-coding genes, withsignificant enrichment of downregulated genes in processes related to meiosis andspermatogenesis, and upregulated genes involved in immune response, apoptosis, andcell adhesion. Additionally, interactome and pathway analysis identified several key hubgenes and signaling pathways, such as the cell cycle and PI3K-AKT pathway, offering newinsights into the disrupted molecular networks in iNOA. The present thesis demonstrated that unlike other sperm phenotypes, azoospermiaprevalence is a stable parameter of infertility. GWAS revealed novel gene candidates,while the RNA-seq, identified a distinct transcriptomic signature for men diagnosed withiNOA. The genetic findings of the present thesis are innovative as they were conductedin men of Greek ancestry, an ethnic group previously under-represented, and open theroad to new research opportunities towards improving understanding of thepathophysiology of human spermatogenesis and developing new more efficient andpersonalized therapeutic approaches. Overall, by integrating longitudinal clinical datawith genetic and transcriptomic evidence, this thesis significantly advances theunderstanding and clinical management of NOA.

Η υπογονιμότητα αποτελεί ένα παγκόσμιο ζήτημα δημόσιας υγείας, επηρεάζοντας περίπου το 17,5% των ζευγαριών, με τον ανδρικό παράγοντα να συμβάλλει σε περίπου 50% των περιπτώσεων. Η αζωοσπερμία, δηλαδή η πλήρης απουσία σπερματοζωαρίων στο δειγμα εκσπερματισης, αποτελεί τη σοβαρότερη μορφή ανδρικής υπογονιμότητας. Η παρούσα διατριβή παρέχει μία λεπτομερή περιγραφή της ανθρώπινης σπερματογένεσης και μία ολοκληρωμένη εισαγωγή στην αζωοσπερμία, συμπεριλαμβανομένων των τύπων της, ενώ παρουσιάζει τις πλέον σύγχρονες κλινικές πρακτικές διαχείρισης ανδρών με αζωοσπερμία. Ακολουθεί εκτενής ανασκόπηση της γνωστής γενετικής βάσης, καθώς και των αναδυόμενων γενετικών δεικτών που σχετίζονται με τη μη αποφρακτική αζωοσπερμία, με έμφαση στα διαθέσιμα δεδομένα από μελέτες συσχέτισης σε όλο το γονιδίωμα (GWAS) και μεταγραφωμικές μελέτες.Μετα-ανάλυση 11.323 καταγραφών σπερμοδιαγραμμάτων από τη βάση δεδομένων της Κλινικής Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής Embryolab, σε χρονικό διάστημα 18 ετών (2008–2025), κατέδειξε σημαντική μείωση της συχνότητας του φαινοτύπου της νορμοσπερμίας (−1,76% ανά έτος) και παράλληλη αύξηση των παθολογικών φαινοτύπων σπέρματος, με ιδιαίτερη έμφαση στην τερατοσπερμία (+3,35% ανά έτος). Η αζωοσπερμία αποτέλεσε τον μοναδικό σταθερό φαινότυπο σπέρματος, με μέση συχνότητα 7,35% καθ’ όλη τη διάρκεια της περιόδου μελέτης. Επιπλέον, αναλύθηκαν τα κλινικά αποτελέσματα 300 ανδρών με αζωοσπερμία που υποβλήθηκαν σε micro-TESE στο πλαίσιο της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Η ανάκτηση σπερματοζωαρίων ήταν επιτυχής στο 89% των περιπτώσεων. Στη συνέχεια η κλινική απόδοση των ορχικών σπερματοζωαρίων συγκρίθηκε μεταξύ διαφορετικών ιστολογικών υποομάδων του όρχεως, καθώς και μεταξύ νωπών και κατεψυγμένων (μετά από απόψυξη) ορχικών σπερματοζωαρίων. Υψηλότερα ποσοστά γονιμοποίησης καταγράφηκαν με τη χρήση νωπών ορχικών σπερματοζωαρίων, καθώς και σε ιστούς με υψηλή ή μέτρια παρουσία σπερματοζωαρίων σε σύγκριση με ιστούς με σπάνια παρουσία σπερματοζωαρίων, ενώ τα ποσοστά εγκυμοσύνης και τοκετού ήταν συγκρίσιμα μεταξύ όλων των ομάδων. Με εστίαση στην αζωοσπερμία και τη σοβαρή ολιγοσπερμία, πραγματοποιήθηκε μελέτη συσχέτισης σε όλο το γονιδίωμα (GWAS), στην οποία συμμετείχαν 85 υπογόνιμοι και 280 γόνιμοι άνδρες ελληνικής καταγωγής. Η μελέτη ανέδειξε επτά νέους γενετικούς πολυμορφισμούς ενός νουκλεοτιδίου (SNPs) που σχετίζονται με την αζωοσπερμία και τη σοβαρή ολιγοσπερμία. Οι πολυμορφισμοί αυτοί εντοπίστηκαν εντός ή πλησίον πρωτεϊνοκωδικών γονιδίων (GRID2, SLC2A12, FBXW2 και CYP2C8), καθώς και μακρών διαγονιδιακών μη κωδικών RNA (LINC01756, SNHG14 και AC090457.1), υποδεικνύοντας την εμπλοκή ποικίλων βιολογικών μηχανισμών που ενδέχεται να συμβάλλουν στη παθοφυσιολογία της σπερματογένεσης. Η λειτουργική ανάλυση κατέδειξε ότι αρκετές από αυτές τις γενετικές παραλλαγές ενδέχεται να επηρεάζουν την έκφραση γονιδίων μέσω eQTL επιδράσεων, με ιδιαίτερη έμφαση στο γονίδιο SGK1, το οποίο εμπλέκεται στη λειτουργία των κυττάρων Sertoli και στη διατήρηση της ακεραιότητας του αιματοορχικού φραγμού. Η μεταγραφωμική μελέτη που ακολούθησε διερεύνησε τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης 26 ορχικών ιστών από άνδρες με διάγνωση ιδιοπαθούς μη αποφρακτικής αζωοσπερμίας (iNOA) και αποφρακτικής αζωοσπερμίας (OA, ομάδα ελέγχου), με τη χρήση αλληλούχισης RNA μαζικού δείγματος (bulk RNA-seq). Η συγκριτική ανάλυση ανέδειξε 3.858 πρωτεϊνοκωδικά γονίδια, που εμφανίζουν σημαντικα διαφορετικα επίπεδα έκφρασης στις ομάδες μελέτης σε σχέση με την ομάδα ελεγχου, με σημαντικό εμπλουτισμό υποεκφραζόμενων γονιδίων που σχετίζονται με τη μείωση και τη σπερματογένεση, καθώς και υπερεκφραζόμενων γονιδίων που εμπλέκονται σε βιολογικές διεργασίες όπως η ανοσολογική απόκριση, η απόπτωση και η κυτταρική προσκόλληση. Επιπλέον, η ανάλυση αλληλεπιδραστικών δικτύων και μονοπατιών ανέδειξε βασικά γονίδια-κόμβους που συμμετέχουν σε κρίσιμα σηματοδοτικά μονοπάτια, όπως ο κυτταρικός κύκλος και το μονοπάτι PI3K-AKT. Η παρούσα διατριβή κατέδειξε ότι, σε αντίθεση με άλλους φαινοτύπους σπέρματος, η συχνότητα της αζωοσπερμίας παρέμεινε σταθερή καθ’ όλη τη διάρκεια της περιόδου μελέτης. Η μελέτη GWAS ανέδειξε νέους υποψήφιους γονιδιακούς στόχους, ενώ η ανάλυση RNA-seq προσδιόρισε ένα διακριτό μεταγραφωμικό αποτύπωμα για άνδρες με διάγνωση iNOA. Τα γενετικά ευρήματα της παρούσας διατριβής είναι καινοτόμα, καθώς προέρχονται από άνδρες ελληνικής καταγωγής — έναν πληθυσμό που έως σήμερα υποεκπροσωπείται στη διεθνή βιβλιογραφία — και ανοίγουν νέες προοπτικές για την κατανόηση της παθοφυσιολογίας της ανθρώπινης σπερματογένεσης και την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών και εξατομικευμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Συνολικά, μέσω της ενσωμάτωσης διαχρονικών κλινικών δεδομένων με γενετικά και μεταγραφωμικά ευρήματα, η παρούσα διατριβή συμβάλλει ουσιαστικά στη βελτίωση της κατανόησης και της κλινικής διαχείρισης της μη αποφρακτικής αζωοσπερμίας.