Study of the toxicity of pesticides of biological origin on the soil microorganisms

Abstract

Agricultural systems rely heavily on synthetic pesticides to protect crops against pests and diseases. However, residues of these pesticides often persist in soils and water, leading to contamination that threatens soil biodiversity and disrupts key ecosystem processes. Of particular concern, synthetic pesticides can negatively affect non-target soil microbial groups, including key functional microbial guilds such as ammonia oxidizing microorganisms (AOM) that drive nitrification, a rate limiting step in N cycling. Such disturbances can reduce soil resilience and compromise overall ecosystem heath.Biopesticides, considered a more environmentally friendly alternative due to their perceived lower toxicity, are receiving growing interest as potential alternatives to synthetic chemical pesticides. This class includes plant-derived secondary metabolites (e.g., dihydrochalcone, isoflavone, aliphatic phenol, and pyrethrins) and microbe-derived compounds (e.g., spinosad), which are the focus of this thesis. However, given their biosynthetic origin and evolutionary role in defence, these compounds likely retain some degree of biocidal activity. This raise concerns that their use could have unintended effects on non-target soil microbial groups (e.g., AOM and arbuscular mycorrhizal fungi) and key ecosystem functions such as C and N cycling. These concerns are particularly relevant, as the current ERA for soil microorganisms relies largely on a single standardized test (OECD 216), which often fails to detect subtle yet important microbial responses. To overcome this limitation, molecular approaches like qPCR and amplicon sequencing can provide high-resolution data on microbial abundance, diversity, and community composition. Integration of these molecular endpoints into environmental risk assessment (ERA) frameworks, complemented by advanced statistical / modelling approaches like Species Sensitivity Distributions (SSDs), presents a promising opportunity to modernize the process. This methodology can establish more ecologically relevant protection thresholds, leading to a more comprehensive and accurate assessment of potential negative effects of both biopesticide and synthetic pesticides. With this in mind, we aimed to (i) compare the toxicity of biopesticides and synthetic pesticides to soil microbiota; (ii) evaluate if high-resolution methods like qPCR reveal potential adverse effects on microbial communities that might be overlooked by the OECD 216 test; (iii) analyse the potential broader impact of biopesticides on microbial diversity and composition via amplicon sequencing; and finally (iv) assess the potential use of the SSD approach to determine ecotoxicological thresholds for ERA. In Chapter 2, we employed the OECD 216 N transformation test to assess the potential negative effects of selected natural products (dihydrochalcone, isoflavone, aliphatic phenol, and spinosad) and a synthetic compound (3,5-dichloroaniline, 3,5-DCA, a transformation product of the fungicide iprodione) on the soil microbiota. The compounds were tested at both the recommended (1x) and ten times the recommend dose (10x). Simultaneously, we conducted a comparative assessment using advanced, an ISO standardized molecular tool (q-PCR) to quantify the abundance of target phylogenetically (i.e. bacteria) and functionally distinct microbial groups (AOM). All pesticides exhibited limited persistence in soil, with mean DT50 values ranging from 0.93 to 27.23 days across all soils and dose rates. According to the OECD 216 endpoint, none of the compounds caused changes in NO₃⁻ concentrations greater than 25% relative to the control at 28 days, indicating no unacceptable effects on soil microbiota according to the regulatory framework in place. In contrast, qPCR measurements revealed significant inhibitory effects, demonstrating a consistent and pronounced reduction (exceeding 25% in most cases) in the abundance of both AOA and AOB following exposure to both the natural products and the synthetic 3,5-DCA. The findings of Chapter 2 demonstrate a critical limitation of the current regulatory framework, as the standard test failed to detect these functionally important microbial responses. This provided the necessary evidence to proceed with are a more comprehensive investigation of community-level effects using higher-resolution omic approaches in Chapter 3. In Chapter 3, our research was expanded to investigate the broader ecological impact of pesticides on soil microbial communities. Using amplicon sequencing, we explored the effects of five biopesticides (dihydrochalcone, isoflavone, aliphatic phenol, spinosad, and pyrethrins) and one synthetic pesticide (chlorothalonil) across a dose gradient (0.2, 0.6, 1.8, 5.4, 16.2, and 48.6 μg g-1) on the diversity and composition of bacterial, fungal, and protist communities in two contrasting soils. As observed in Chapter 2, all pesticides exhibited limited persistence, with mean DT50 values ranging from 0.86 to 15.39 days. The synthetic pesticide chlorothalonil consistently demonstrated the highest toxicity, significantly disrupting bacterial and protist communities. Among the biopesticides, pyrethrins were the next most impactful, while the other plant- and microbe-derived compounds exhibited minimal effects. The amplicon sequencing data was then used to construct SSDs. This approach enabled the derivation of quantitative Hazard Concentration 5% (HC5) values. Notably, chlorothalonil had substantially lower HC5 values (2.8 - 18.6 μg g⁻¹ for bacteria; 7.9 μg g⁻¹ for protists) than those of the biopesticides (pyrethrins: 43.0 μg g⁻¹ for protists; dihydrochalcone: 45.8 μg g⁻¹ for bacteria). This chapter provides a pioneering methodology for moving from qualitative community data into quantitative risk assessment, providing a novel framework for deriving ecologically relevant safety thresholds for soil microorganisms. Finally, our study demonstrates that the current regulatory framework for pesticide ERA is inadequate for protecting soil microbial communities. We provide robust evidence that molecular tools are important for detecting the real impact of pesticides, including those of biological origin. Furthermore, we establish a novel paradigm by successfully applying the SSDs to amplicon sequencing data, thereby bridging a critical gap between modern microbial ecology and regulatory ecotoxicology. This work lays the foundation for the development of a more sensitive, relevant, and protective risk assessment strategy for soil ecosystems.

Η σύγχρονη γεωργία βασίζεται σε μεγάλο βαθμό στην χρήση συνθετικών χημικών φυτοπροστατευτικών ουσιών για την προστασία των καλλιεργειών από τα παράσιτα και τις ασθένειες. Ωστόσο, τα υπολείμματα των φυτοπροστατευτικών ουσιών συχνά εμμένουν στα εδαφικά και υδάτινα οικοσυστήματα, οδηγώντας σε ρύπανση που απειλεί τη βιοποικιλότητα του εδάφους και διαταράσσει βασικές οικοσυστημικές λειτουργίες. Ιδιαίτερη ανησυχία προκαλεί το γεγονός ότι οι συνθετικές φυτοπροστατευτικές ουσίες μπορούν να επηρεάσουν αρνητικά σημαντικές ομάδες μικροοργανισμών του εδάφους, συμπεριλαμβανομένων βασικών λειτουργικών μικροβιακών ομάδων όπως οι νιτρωδοποιητικοί μικροοργανισμοί (ΑΟΜ), που είναι υπεύθυνοί για την νιτροποίηση, το ρυθμο-καθοριστικό βήμα στον κύκλο του αζώτου. Τέτοιες διαταραχές μπορούν να μειώσουν την ανθεκτικότητα του εδάφους και να θέσουν σε κίνδυνο τη υγεία και ομοιόσταση του οικοσυστήματος. Οι βιολογικής προέλευσης φυτοπροστατευτικές ουσίες, οι οποίες θεωρούνται περισσότερο φιλικές προς το περιβάλλον λόγω της πιθανολογούμενης χαμηλότερης τοξικότητάς τους, προσελκύουν ολοένα και μεγαλύτερο ενδιαφέρον ως εναλλακτικές λύσεις έναντι των συνθετικών φυτοπροστατευτικών. Η κατηγορία αυτή περιλαμβάνει δευτερογενείς μεταβολίτες των φυτών (π.χ. dihydrochalcone, isoflavone, aliphatic phenols, πυρεθρίνες) και ενώσεις μικροβιακής προέλευσης (π.χ. spinosyns), που αποτελούν το αντικείμενο αυτής της διατριβής. Ωστόσο, δεδομένης της βιολογικής τους προέλευσης και του ρόλου τους στην άμυνα φυτών και μικροοργανισμών, είναι ιδιαίτερα πιθανό να έχουν αντι-μικροβιακές ιδιότητες. Αυτό εγείρει ανησυχίες ότι η χρήση τους μπορεί να έχει επιπτώσεις σε σημαντικές λειτουργικές μικροβιακές ομάδες (π.χ. ΑΟΜ και δενδρόμορφους μυκορριζικούς μύκητες), με παρεπόμενες επιπτώσεις σε βασικές λειτουργίες του οικοσυστήματος όπως ο κύκλος του άνθρακα και του αζώτου. Αυτές οι ανησυχίες είναι ιδιαίτερα σημαντικές, καθώς σήμερα η αξιολόγηση της επικινδυνότητας (ERA) των φυτοπροστατευτικών ενώσεων για τους μικροοργανισμούς του εδάφους βασίζεται σε μεγάλο βαθμό σε μια παρωχημένη δοκιμή (OECD 216), η οποία συχνά αποτυγχάνει να ανιχνεύσει μικρές αλλά σημαντικές μικροβιακές αποκρίσεις. Η αντιμετώπιση του παραπάνω προβλήματα απαιτεί την χρήση στην ERA σύγχρονων μοριακών προσεγγίσεων όπως η qPCR και η μεταταξινομική ανάλυση. Οι παραπάνω μέθοδοι μπορούν να προσφέρουν δεδομένα υψηλής ανάλυσης σχετικά με την αφθονία, τη λειτουργία και τη σύνθεση των μικροβιακών κοινοτήτων. Η ενσωμάτωση αυτών των μοριακών προσεγγίσεων στην διαδικασία της ERA, σε συνδυασμό με την χρήση προηγμένων εργαλείων βιοπληροφορικής και βιοστατιστικής όπως οι καμπύλες κατανομές ειδών (SSDs), προσφέρουν μια ευκαιρία για τον εκσυγχρονισμό της διαδικασίας αξιολόγησης της τοξικότητας των φυτοπροστατευτικών ουσιών έναντι των μικροοργανισμών του εδάφους. Η συγκεκριμένη προσέγγιση μπορεί να οδηγήσει στην διαμόρφωση ποσοτικών δεδομένων εκτίμησης της μικροβιακής τοξικότητας, οδηγώντας σε πιο ολοκληρωμένη και ακριβή αξιολόγηση των πιθανών αρνητικών επιπτώσεων τόσο των βιολογικών όσο και των συνθετικών φυτοπροστατευτικών ενώσεων έναντι των μικροοργανισμών του εδάφους. Λαμβάνοντας αυτά υπόψη, θέσαμε ως κύριους στόχους της διδακτορικής διατριβής: (i) να αξιολογήσουμε συγκριτικά την τοξικότητα των βιολογικών και των συνθετικών φυτοπροστατευτικών ουσιών στη μικροβιακή κοινότητα του εδάφους· (ii) να διερευνύσουμε εάν μοριακές μέθοδοι υψηλής ευκρίνειας όπως η qPCR μπορούν να αναδείξουν πιθανές αρνητικές επιδράσεις στις μικροβιακές κοινότητες του εδάφους που ενδέχεται να μην εντοπίζονται από τη δοκιμή OECD 216· (iii) να αναλύσουμε τις ευρύτερες επιπτώσεις των βιολογικών φυτοπροστατευτικών ουσιών στη μικροβιακή ποικιλότητα του εδάφους μέσω της χρήσης μεταταξινομικών προσεγγίσεων· και τέλος (iv) να αξιολογήσουμε τη δυνατότητα χρήσης των SSDs στην αξιολόγηση της επικινδυνότητας των φυτοπροστατευτικών ενώσεων ως προς του μικροοργανισμούς του εδάφους. Στο Κεφάλαιο 2, χρησιμοποιήσαμε τη δοκιμή OECD 216 για να αξιολογήσουμε τις πιθανές αρνητικές επιδράσεις επιλεγμένων φυσικών προϊόντων (dihydrochalcone, isoflavone, aliphatic phenol, Spinosad) καθώς και ενός συνθετικού φυτοπροστατευτικού προϊόντος (3,5-dichloroaniline, προϊόν μετασχηματισμού του μυκητοκτόνου iprodione) στη μικροβιακή κοινότητα του εδάφους. Οι ενώσεις αξιολογήθηκαν για τις επιπτώσεις τους τόσο στη συνιστώμενη δόση (1x) όσο και σε δέκα φορές τη συνιστώμενη δόση (10x). Πραγματοποιήθηκε συγκριτική αξιολόγηση των επιπτώσεων των φυτοπροστατευτικών ενώσεων με τη χρήση ενός προηγμένου, πιστοποιημένου κατά ISO μοριακού εργαλείου (q-PCR) για τον προσδιορισμό της αφθονίας φυλογενετικά και λειτουργικά διακριτών μικροβιακών ομάδων όπως βακτήρια, μύκητες αλλά και ΑΟΜ. Όλα τα φυτοφάρμακα εμφάνισαν περιορισμένη υπολειμματικότητα στο έδαφος, με μέσες τιμές DT50 που κυμαίνονταν από 0,93 έως 27,23 ημέρες σε όλους τους τύπους εδαφών και επίπεδα δόσης. Σύμφωνα με την δοκιμή OECD 216, καμία από τις ουσίες που αξιολογήθηκαν δεν προκάλεσε μεταβολές στις συγκεντρώσεις NO₃⁻ μεγαλύτερες από 25% σε σχέση με τον μάρτυρα στις 28 ημέρες, υποδεικνύοντας σύμφωνα με το κανονιστικό πλαίσιο της δοκιμής OECD 216 ότι οι συγκεκριμένες φυτοπροστατευτικές ουσίες δεν προκαλούν μη αποδεκτές επιδράσεις στη μικροβιακή κοινότητα του εδάφους. Αντιθέτως, χρησιμοποιώντας στο ίδιο πείραμα την μέθοδο qPCR εντοπίσαμε σημαντικές ανασταλτικές επιδράσεις στην αφθονία τόσο των AOA όσο και των AOB στα δείγματα που είχαν δεχτεί εφαρμογή των βιολογικών φυτοπροστατευτικών ουσιών αλλά και του 3,5-DCA. Τα παραπάνω ευρήματα αναδεικνύουν την περιορισμένη διακριτική ικανότητα του τρέχοντος κανονιστικού πλαισίου για την αξιολόγηση της τοξικότητας των φυτοπροστατευτικών ενώσεων στους μικροοργανισμούς του εδάφους, καθώς η δοκιμή OECD 216 απέτυχε να ανιχνεύσει σημαντικές επιδράσεις στην μικροβιακή κοινότητα του εδάφους που εντοπίστηκαν με την χρήση προηγμένων μοριακών εργαλείων. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα προχωρήσαμε σε μια πιο ολοκληρωμένη διερεύνηση των επιδράσεων των βιολογικών φυτοπροστατευτικών ενώσεων σε επίπεδο κοινότητας, χρησιμοποιώντας ομικές τεχνικές στο Κεφάλαιο 3. Στο Κεφάλαιο 3, η έρευνα μας επεκτάθηκε στην διερεύνηση των ευρύτερων οικολογικών επιπτώσεων των φυτοπροστατευτικών ενώσεων στις μικροβιακές κοινότητες του εδάφους. Για να το καταφέρουμε αυτό χρησιμοποιήσαμε εργαλεία μεταταξινομικής , και μελετήθηκαν οι επιδράσεις πέντε βιολογικών φυτοπροστατευτικών ουσιών (dihydrochalcone, isoflavone, aliphatic phenol, Spinosad και πυρεθρίνες) και μιας συνθετικής φυτοπροστατευτικής ουσίας (chlorothalonil), σε ένα εύρος δόσεων (0.2, 0.6, 1.8, 5.4, 16.2 και 48.6 μg g⁻¹), στην ποικιλότητα και σύσταση της κοινότητας των βακτηριών, μυκήτων και πρωτίστων σε δύο εδάφη με διαφορετικά φυσικοχημικά χαρακτηριστικά. Όπως παρατηρήθηκε και στο Κεφάλαιο 2, όλες οι φυτοπροστατευτικές ουσίες που αξιολογήθηκαν εμφάνισαν περιορισμένη υπολειμματικότητα στο έδαφος, με μέσες τιμές DT50 που κυμαίνονταν από 0,86 έως 15,39 ημέρες. Το chlorothalonil παρουσίασε σταθερά τη υψηλότερη τοξικότητα, διαταράσσοντας σε σημαντικό βαθμό την σύσταση των κοινοτήτων των βακτηρίων και πρωτίστων. Από τις βιολογικές φυτοπροστατευτικές ουσίες που αξιολογήθηκαν, οι πυρεθρίνες εμφάνισαν τις μεγαλύτερες επιδράσεις, ενώ οι υπόλοιπες ενώσεις βιολογικής προέλευσης δεν προκάλεσαν σημαντικές μεταβολές στις μικροβιακές κοινότητες του εδάφους. Τα δεδομένα από την μεταταξινομική ανάλυση των μικροβιακών κοινοτήτων του εδάφους χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή SSD από τις οποίες παραλήφθηκαν τιμές Hazard Concentration 5% (HC5) για τις διάφορες φυτοπροστατευτικές ουσίες στα δύο εδάφη. Αξιοσημείωτο είναι ότι το chlorothalonil παρουσίασε σημαντικά χαμηλότερες τιμές HC5 (2.8 - 18.6 μg g⁻¹ για τα βακτήρια· 7.9 μg g⁻¹ για τα πρωτίστια) σε σύγκριση με τα βιολογικής προέλευσης φυτοπροστατευτικά όπως οι πυρεθρίνες (43.0 μg g⁻¹) για τα πρωτίστια και το dihydrochalcone (45.8 μg g⁻¹) για τα βακτήρια. Το κεφάλαιο αυτό εισάγει μια πρωτοποριακή μεθοδολογία, μεταβαίνοντας από ποιοτικά δεδομένα μικροβιακών κοινοτήτων σε ποσοτική εκτίμηση κινδύνου, προσφέροντας ένα νέο πλαίσιο για την παραλαβή οικοτοξικολογικών παραμέτρων για τους μικροοργανισμούς του εδάφους. Τέλος, η μελέτη μας αποδεικνύει ότι το υπάρχον κανονιστικό πλαίσιο για την αξιολόγηση της επικινδύνοτητας των φυτοπροστατευτικών ουσιών όσων αφορά τους είναι ανεπαρκές για την προστασία των μικροβιακών κοινοτήτων του εδάφους. Τα δεδομένα μας παρέχουν ισχυρές αποδείξεις ότι ή χρήση των νέων μοριακών εργαλείων είναι απαραίτητη για την ανίχνευση των πραγματικών επιπτώσεων των φυτοπροστατευτικών ουσιών, συμπεριλαμβανομένων και εκείνων βιολογικής προέλευσης στις μικροβιακές κοινότητες του εδάφους. Επιπλέον, θεμελιώνουμε ένα νέο παράδειγμα αξιοποίησης των SSDs, γεφυρώνοντας έτσι ένα κρίσιμο κενό μεταξύ της σύγχρονης μικροβιακής οικολογίας και της οικοτοξικολογίας. Η εργασία αυτή θέτει τα θεμέλια για την ανάπτυξη μιας πιο ευαίσθητης, ουσιαστικής και προστατευτικής στρατηγικής αξιολόγησης επικινδυνότητας για τα εδαφικά οικοσυστήματα.