Development of mass spectrometry methods for metallomic analysis in environmental and biological systems

Abstract

This thesis addresses key analytical challenges in metallomics by developing and applying mass spectrometry-based methods for the study and characterization of metallobiomolecules and selected metal and metalloid species in environmental and biological systems. Metal(oid)s in such systems are typically monitored as total concentrations, yet it is their speciation and association with biomolecules that ultimately governs bioavailability, toxicity, and physiological function. Here, size-exclusion chromatography coupled to inductively coupled plasma mass spectrometry (SEC-ICP-MS) and complementary liquid chromatography-mass spectrometry platforms are advanced and applied across a set of human, fish, and microalgal matrices to obtain multi-element, size-resolved, and molecular-level information. First, a SEC-ICP-MS platform was developed for comprehensive metallobiomolecule profiling in human blood serum. The method enables the simultaneous detection and quantification of thirteen metals, metalloids and eteroatoms (cobalt (Co), magnesium (Mg), calcium (Ca), copper (Cu), zinc (Zn), iron (Fe), manganese (Mn), lead (Pb), selenium (Se), mercury (Hg), sulfur (S), phosphorus (P) and iodine (I)) in a single analysis by combining size-based separation of native complexes (0.5-150 kDa) with post-column flow injection for element calibration, total element determination, and monitoring of instrument stability. Validation against a human serum reference material (Seronorm Trace Elements Level 2) showed element recoveries generally above 80 % and demonstrated the effectiveness of an on-column EDTA strategy to enhance column recoveries and minimize carryover. In addition to confirming known metallobiomolecule bands, the method revealed previously unreported aspects of element partitioning in this widely used reference material, highlighting its value for method development, quality control, and biomarker-oriented studies.The platform was then applied to the blood serum of aquaculture-reared Dicentrarchus labrax and Sparus aurata to obtain multi-element metallobiomolecule size profiles and to investigate the effects of long-term storage at −20 °C. For nine elements (Mg, Zn, Co, Ca, Cu, Fe, Mn, Se, and Pb), metals were distributed among several reproducible high- and low-molecular-mass bands, whose size profiles were compared with literature reports of metallobiomolecules in similar apparent molecular mass ranges. The two species showed broadly conserved profiles but with distinct quantitative and species-specific differences, especially in low-molecular-mass fractions and Pb-binding pools. A two-year storage experiment revealed extensive redistribution of metals among chromatographic bands, while total recoveries remained largely unchanged, underlining that storage conditions critically affect native metallobiomolecule and metal(oid) distributions in metallomic studies. Subsequently, the SEC-ICP-MS application was extended from serum to fish muscle, focusing on the low ionic strength soluble (sarcoplasmic) fraction of four commercially important Mediterranean species (Mullus barbatus, Pagellus erythrinus, Merluccius merluccius, Engraulis encrasicolus). A low ionic strength extraction protocol, compatible with SEC-ICP-MS, was optimized to preserve native metallobiomolecules, and multi-element profiles for Co, Mg, Ca, Cu, Zn, Fe, and Mn were obtained. Three to six metallobiomolecule bands per element were typically observed, spanning from <0.5 kDa to >150 kDa. The observed size ranges were compared with literature data on muscle metalloproteins in similar apparent molecular mass ranges. Species and, in some cases, sex, strongly influenced the distribution of metals between high- and low-molecular-mass fractions, whereas such differences were not evident from total metal concentrations alone. The sarcoplasmic fraction, therefore, provides valuable information on the metallome of edible fish tissue, with implications for biomonitoring, nutrition, and ecotoxicology. In parallel, Se and Hg were investigated in farmed D. labrax muscle to link metallomics with food safety and risk-benefit assessment. Total Se and Hg were determined by ICP-MS following microwave-assisted digestion, while Se speciation was quantified by HPLC-ICP-MS after optimized enzymatic extraction and anion-exchange separation. Selenomethionine was identified as the dominant Se species, accounting for the majority of total Se, with inorganic Se largely below detection limits. Mean Hg concentrations were well below regulatory limits, and both Se:Hg molar ratios and selenium health benefit values were consistently >1, even under conservative assumptions. Seasonal and site-related variability in Se and Hg levels was moderate. The observed patterns were largely associated with differences in diet and production cycle for Se, while Hg also showed an influence of environmental conditions at the aquaculture sites. Overall, the results indicate that farmed D. labrax can provide substantial Se intake while maintaining low Hg exposure and a favorable Se-Hg balance. Finally, the thesis examined lipid-soluble arsenic species (arsenolipids) in freshwater green microalgae exposed to arsenate (As(V)). Chlamydomonas reinhardtii and Chlorella sorokiniana were incubated across a gradient of As(V) concentrations, and cell growth, total As, and metal micronutrient uptake (Cu, Fe, Zn, and Mn), and lipid unsaturation were monitored. Lipophilic As species were screened by RP-HPLC-ICP-MS and structurally characterized by high-resolution RP-HPLC-ESI-Orbitrap-MS. C. reinhardtii showed pronounced growth inhibition, high As accumulation, and a diverse arsenolipidome dominated by arsenosugar-containing phytols and phospholipids, with non-linear trends in arsenolipid abundance as a function of As(V) exposure. In contrast, C. sorokiniana exhibited greater tolerance, lower As concentration, and negligible arsenolipid production under the same conditions. These findings indicate that arsenolipid biosynthesis is species-specific, governed primarily by As levels and physiological stress, and is associated with changes in lipid metabolism. Collectively, this thesis demonstrates that chromatographic-mass spectrometric platforms can be optimized to provide detailed, multi-element metallobiomolecule and metal(oid)s species profiles across diverse matrices. By integrating method development with applications in human serum, fish serum and muscle, and microalgae, it advances the analytical basis of metallomics and provides new insights relevant to biomarker discovery, environmental monitoring, ecotoxicology, and food safety.

Η παρούσα διατριβή εξετάζει βασικές αναλυτικές προκλήσεις στη μεταλλωμική. Αναπτύσσονται και εφαρμόζονται μέθοδοι βασισμένες στη φασματομετρία μάζας για τη μελέτη και τον χαρακτηρισμό μεταλλοβιομορίων και επιλεγμένων ειδών μετάλλων και μεταλλοειδών σε περιβαλλοντικά και βιολογικά συστήματα. Σε τέτοια συστήματα συνήθως προσδιορίζονται οι ολικές συγκεντρώσεις των μετάλλων και μεταλλοειδών, ωστόσο η χημική τους μορφή και η σύνδεσή τους με βιομόρια καθορίζουν τη βιοδιαθεσιμότητα, την τοξικότητα και τη λειτουργία τους στους οργανισμούς. Στο πλαίσιο αυτό, η χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού σε συνδυασμό με τη φασματομετρία μάζας επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (SEC-ICP-MS), καθώς και επιπλέον τεχνικές υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας αναπτύσσονται και εφαρμόζονται σε ένα σύνολο δειγμάτων προερχόμενων από ανθρώπους, ψάρια και μικροάλγη με στόχο την λήψη πολυστοιχειακών πληροφοριών σε μοριακό επίπεδο.Αρχικά, αναπτύχθηκε μια πλατφόρμα SEC-ICP-MS για την ανάλυση μεταλλοβιομορίων στον ανθρώπινο ορό αίματος. Η πλατφόρμα επιτρέπει την ταυτόχρονη ανίχνευση και ποσοτικοποίηση δεκατριών μετάλλων, μεταλλοειδών και ετεροατόμων (κοβαλτίου (Co), μαγνησίου (Mg), ασβεστίου (Ca), χαλκού (Cu), ψευδαργύρου (Zn), σιδήρου (Fe), μαγγανίου (Mn), μολύβδου (Pb), σεληνίου (Se), υδραργύρου (Hg), θείου (S), φωσφόρου (P) και ιωδίου (I)) σε μία μόνο ανάλυση, συνδυάζοντας τον διαχωρισμό βάσει του μεγέθους των συμπλόκων (0.5-150 kDa) με έγχυση ροής μετά τη στήλη για τη βαθμονόμηση των στοιχείων, τον προσδιορισμό των ολικών συγκεντρώσεων των στοιχείων και την παρακολούθηση της σταθερότητας του οργάνου. Η επικύρωση της μεθόδου με ένα υλικό αναφοράς ανθρώπινου ορού αίματος (Seronorm Trace Elements Level 2) έδειξε ανακτήσεις στοιχείων άνω του 80 % και κατέδειξε την αποτελεσματικότητα της έγχυσης EDTA στη στήλη, τόσο για την αύξηση των ανακτήσεων από τη χρωματογραφική στήλη όσο και για την ελαχιστοποίηση της επιμόλυνσης μεταξύ διαδοχικών αναλύσεων. Πέρα από την επιβεβαίωση της παρουσίας μεταλλοβιομορίων σε γνωστά εύρη μοριακών βαρών, η μέθοδος παρείχε πρόσθετες πληροφορίες για τα μεταλλοβιομόρια που περιέχονται σε αυτό το ευρέως χρησιμοποιούμενο υλικό αναφοράς, αναδεικνύοντας τη σημασία του για την ανάπτυξη μεθόδων, τον ποιοτικό έλεγχο και μελέτες που επικεντρώνονται στην αναζήτηση βιοδεικτών. Στη συνέχεια, η πλατφόρμα εφαρμόστηκε στον ορό αίματος από Ευρωπαϊκό λαβράκι (Dicentrarchus labrax) και τσιπούρα (Sparus aurata) που εκτράφηκαν σε υδατοκαλλιέργειες, με στόχο την απόκτηση πολυστοιχειακών προφίλ μεταλλοβιομορίων και τη διερεύνηση των επιδράσεων της μακροχρόνιας αποθήκευσης στους -20 °C σε αυτά. Για εννέα στοιχεία (Mg, Zn, Co, Ca, Cu, Fe, Mn, Se, και Pb), παρατηρήθηκε κατανομή των μετάλλων σε πολλαπλά κλάσματα υψηλού και χαμηλού μοριακού βάρους, τα προφίλ των οποίων συγκρίθηκαν με δεδομένα της βιβλιογραφίας για μεταλλοβιομόρια που έχουν ανιχνευθεί σε ορό αίματος. Τα δύο είδη εμφάνισαν παρόμοια ποιοτικά προφίλ, ωστόσο παρατηρήθηκαν ποσοτικές διαφοροποιήσεις καθώς και διαφορές που σχετίζονταν με το είδος του ψαριού, ιδιαίτερα στα κλάσματα χαμηλού μοριακού βάρους και εκείνα που περιείχαν Pb. Η ανάλυση δειγμάτων ορού που αποθηκεύτηκαν για δύο έτη στους -20 °C αποκάλυψε εκτεταμένη ανακατανομή των μετάλλων μεταξύ των χρωματογραφικών κλασμάτων, ενώ οι συνολικές ανακτήσεις παρέμειναν σε μεγάλο βαθμό αμετάβλητες, υπογραμμίζοντας ότι οι συνθήκες αποθήκευσης επηρεάζουν σημαντικά την κατανομή των μετάλλων και των μεταλλοειδών στα διάφορα μεταλλοβιομόρια και αποτελούν κρίσιμο παράγοντα στις μεταλλωμικές μελέτες. Έπειτα, η εφαρμογή SEC-ICP-MS επεκτάθηκε από τον ορό στους μυς των ψαριών, με έμφαση στο διαλυτό (σαρκοπλασματικό) κλάσμα χαμηλής ιοντικής ισχύος τεσσάρων εμπορικά σημαντικών μεσογειακών ειδών (Mullus barbatus, Pagellus erythrinus, Merluccius merluccius, και Engraulis encrasicolus). Ένα πρωτόκολλο εκχύλισης με διάλυμα χαμηλής ιοντικής ισχύος, συμβατό με την SEC-ICP-MS, βελτιστοποιήθηκε για τη διατήρηση της ακεραιότητας των μεταλλοβιομορίων και λήφθηκαν τα προφίλ των μεταλλοβιομορίων για τα Co, Mg, Ca, Cu, Zn, Fe και Mn. Στα περισσότερα προφίλ παρατηρήθηκαν τρεις έως έξι διακριτές ζώνες μεταλλοβιομορίων ανά στοιχείο, οι οποίες εκτείνονταν σε εύρος μοριακών βαρών από <0.5 kDa έως >150 kDa. Τα παρατηρούμενα εύρη μοριακών βαρών συγκρίθηκαν με βιβλιογραφικά δεδομένα που αφορούν μεταλλοπρωτεΐνες των μυών με αντίστοιχα μοριακά βάρη. Το είδος και, σε ορισμένες περιπτώσεις, το φύλο των ψαριών, επηρέασαν σημαντικά την κατανομή των μετάλλων μεταξύ των κλασμάτων υψηλού και χαμηλού μοριακού βάρους, ενώ τέτοιες διαφορές δεν ήταν εμφανείς στις συνολικές συγκεντρώσεις των μετάλλων. Το σαρκοπλασματικό κλάσμα αναδεικνύεται, επομένως, ως σημαντική πηγή πληροφοριών για το μετάλλωμα του βρώσιμου ιστού των ψαριών, με άμεσες εφαρμογές στη βιοπαρακολούθηση, τη διατροφή και την οικοτοξικολογία. Παράλληλα, διερευνήθηκαν το Se και το Hg σε μυς από εκτρεφόμενο Ευρωπαϊκό λαβράκι (D. labrax), με στόχο τη σύνδεση της μεταλλωμικής προσέγγισης με την ασφάλεια των τροφίμων και την αξιολόγηση του ισοζυγίου κινδύνου-οφέλους από την κατανάλωσή τους. Οι ολικές συγκεντρώσεις Se και Hg προσδιορίστηκαν με ICP-MS μετά από πέψη με ισχυρά οξέα υποβοηθούμενη από μικροκύματα, ενώ πραγματοποιήθηκε ειδοταυτοποίηση του Se και ποσοτικοποίηση των επιμέρους ειδών, μετά από βελτιστοποιημένη ενζυμική εκχύλιση, και χρωματογραφία ανιοντοανταλλαγής συζευγμένη με το ICP-MS. Η σεληνομεθειονίνη προσδιορίστηκε ως η κυρίαρχη μορφή Se, αντιπροσωπεύοντας το μεγαλύτερο ποσοστό του συνολικού Se, με το ανόργανο Se να βρίσκεται κάτω από τα όρια ανίχνευσης. Οι μέσες συγκεντρώσεις Hg ήταν σημαντικά χαμηλότερες από τα θεσμοθετημένα όρια και τόσο οι μοριακές αναλογίες Se:Hg όσο και οι τιμές των οφελών του σεληνίου για την υγεία ήταν σταθερά >1, ακόμη και υπό συντηρητικές υποθέσεις. Η εποχική και η χωρική μεταβλητότητα στα επίπεδα Se και Hg ήταν μέτρια. Τα παρατηρούμενα μοτίβα συνδέονταν σε μεγάλο βαθμό με διαφορές στη διατροφή και τον κύκλο παραγωγής όσον αφορά το Se, ενώ το Hg ανέδειξε επιπλέον την επίδραση των περιβαλλοντικών συνθηκών στις περιοχές υδατοκαλλιέργειας. Συνολικά, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το εκτρεφόμενο λαβράκι μπορεί αποτελεί σημαντική πηγή Se, διατηρώντας παράλληλα χαμηλή έκθεση σε Hg και ευνοϊκή ισορροπία Se-Hg. Τέλος, η διατριβή εξέτασε τις λιποδιαλυτές μορφές αρσενικού (αρσενολιπίδια) σε πράσινα μικροάλγη του γλυκού νερού που εκτέθηκαν σε αρσενικικό (As(V)). Κύτταρα Chlamydomonas reinhardtii και Chlorella sorokiniana επωάστηκαν σε εύρος συγκεντρώσεων As(V) και έγινε παρακολούθηση της κυτταρικής ανάπτυξης, της ολικής συγκέντρωσης As, της πρόσληψης μικροθρεπτικών μετάλλων (Cu, Fe, Zn, και Mn) και ο βαθμός ακορεστότητας των λιπιδίων. Τα αρσενολιπίδια αναλύθηκαν με RP-HPLC-ICP-MS και χαρακτηρίστηκαν δομικά με RP-HPLC-ESI-Orbitrap-MS. Το C. reinhardtii παρουσίασε έντονη αναστολή της ανάπτυξης, υψηλή συσσώρευση As και μεγάλη ποικιλομορφία αρσενολιπιδίων, στα οποία κυριαρχούσαν αρσενοσάκχαρα συνδεδεμένα με φυτόλες και φωσφολιπίδια. Παρατηρήθηκαν μη γραμμικές τάσεις στην αφθονία των αρσενολιπιδίων σε συνάρτηση με την έκθεση σε As(V). Αντίθετα, το C. sorokiniana παρουσίασε μεγαλύτερη ανοχή, χαμηλότερη συσσώρευση As και αμελητέα παραγωγή αρσενολιπιδίων κάτω από τις ίδιες συνθήκες έκθεσης. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η βιοσύνθεση αρσενολιπιδίων εξαρτάται από το είδος των μικροάλγεων και καθορίζεται κυρίως από τα επίπεδα As που προσλαμβάνουν, το κυτταρικό στρες που προκαλείται και τις μεταβολές στο μεταβολισμό των λιπιδίων. Συνολικά, η παρούσα διατριβή υποδεικνύει ότι οι μέθοδοι υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας μπορούν να βελτιστοποιηθούν ώστε να παρέχουν λεπτομερή πολυστοιχειακά προφίλ μεταλλοβιομορίων σε ποικίλα βιολογικά και περιβαλλοντικά δείγματα. Μέσω του συνδυασμού ανάπτυξης και εφαρμογής μεθόδων σε ανθρώπινο ορό, ορό και μυς ψαριών, καθώς και σε μικροάλγη, προάγεται η εξέλιξη της μεταλλωμικής και παρέχονται νέες πληροφορίες σχετικές με την ανακάλυψη βιοδεικτών, την παρακολούθηση της περιβαλλοντικής ρύπανσης, την οικοτοξικολογία και την ασφάλεια των τροφίμων.