Γονιδιωματική- μεταγονιδιωματική ανάλυση ειδών οικονομικής σημασίας στην αγροβιολογία

Abstract

This doctoral dissertation focused on the development and comprehensive application of integrated genomic and metagenomic approaches for economically important species within the field of agricultural biology, with a particular emphasis on viticulture. The main objective was to conduct an extensive and detailed analysis of the entire grape-wine production chain, covering every stage from the grape variety itself, through the composition, diversity, and dynamics of associated microbial communities, to the evaluation and characterization of individual microorganisms that appear to play a significant role in influencing both the winemaking process and the overall quality of the final wine products. The selection of grapevine as a primary study system was based on its substantial economic importance, deep-rooted culturalsignificance, and high biotechnological potential within the context of the Greek agricultural sector. Viticulture in Greece has a long historical tradition dating back thousands of years, and grape cultivation remains deeply integrated with regional economies, local culture, and the development of high-value products. In addition, comparable studies were carried out on other economically significant species, including hops and bacterial strains with recognized probiotic potential. Within this framework, a practical, reproducible, and economically viable protocol for varietal genotyping using Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) through NextGeneration Sequencing (NGS) technologies was developed. This protocol allows for accurate and reliable authentication of grapevine varieties, improved management of vineyard resources, and the preservation of the unique genetic heritage of Greek viticulture. Historically, the problem of synonyms and homonyms represents one of the major challenges in viticulture globally, and several studies indicate that similar phenomena exist in Greece, highlighting the importance of developing such genotyping tools to address these issues. Application of this protocol to indigenous Greek grape varieties revealed a substantial level of genetic diversity among the varieties studied, as well as a clear absence of synonyms, thereby ensuring the authenticity and traceability of the genetic material and providing a solid foundation for the development of future targeted breeding programs. In addition, microbial terroir is now widely recognized as an essential factor contributing to the distinct attributes of terroir. Accordingly, studying microbial communities in vineyards and during winemaking is essential for understanding the contributions of these organisms to wine quality. In this context, an in-depth spatiotemporal analysis of the grape-associated microbiome of the Asyrtiko variety demonstrated that both biogeographical factors and vintage-specific conditions significantly influence the composition and structure of microbial communities. In parallel, monitoring of microbial populations during spontaneous fermentations of the Sauvignon Blanc variety revealed clear patterns of microbial succession throughout the fermentation process. These observations highlighted the central role of yeasts,particularly Saccharomyces cerevisiae, in driving fermentation dynamics and underscored the importance of comprehensive genomic characterization of these strains to fully understand their functional capabilities and industrial potential.Importantly, the exploitation of omics technologies, such as Whole Genome Sequencing (WGS), is essential for the valorization of indigenous organisms that provide added value. However, these practices require state-of-the-art sequencing methods and advanced bioinformatic protocols for strain characterization, ensuring that native microorganisms can be safely applied in new wine products as starter cultures to enhance product quality. WGS coupled with advanced bioinformatic analysis of the indigenous Saccharomyces cerevisiae strain PasK102Sc revealed the presence of a previously unregistered, novel yeast strain with notable industrial potential. These findings emphasize the value of using native yeast strains to preserve and enhance the distinct local characteristics and quality attributes of Greek wines, thereby contributing to the conservation of regional oenological identity. Moreover, to ensure methodological robustness, a technical study was designed to comparatively evaluate the different genomic approaches for profiling microbial communities, highlighting the advantages and limitations of each method. Thecomparison of three different metagenomic approaches—shotgun metagenomics, amplicon-based sequencing, and assembly-based approaches — in grape samples demonstrated the superiority of shotgun sequencing. This approach provides a more comprehensive view of microbial diversity, yielding a higher number of taxonomic units, increased resolution at the genus and species levels, and a lower proportion of unclassified sequences compared to both amplicon-based and assembly-based approaches. Overall, despite limitations such as restricted geographic coverage, laboratory-scale experimental fermentations, and the lack of meta-transcriptomic and metabolomic data, the dissertation provides an integrated model that enhances Greek viticulture and oenology from vineyard to bottle. Future prospects include the broader application of modern Molecular Biology techniques to address practical agricultural and industrial challenges, the adaptation of protocols to a wider range of varieties and regions, and the industrial evaluation of promising microorganisms for commercial use. The research further aims to contribute to sustainable production practices, the creation of a national database of genetic information and microbial terroir signatures, and the translation of molecular insights into economically and environmentally viable innovations. By connecting fundamental research with practical applications, this dissertation demonstrates the potential of molecular biology to support traditional viticulture while fostering innovation, sustainability, and competitiveness in the Greek wine sector.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστίασε στην ανάπτυξη και εφαρµογή ολοκληρωµένων γονιδιωµατικών και µεταγονιδιωµατικών προσεγγίσεων για είδη οικονοµικής σηµασίας στην αγροβιολογία, µε έµφαση στην αµπελουργία, στοχεύοντας στην πλήρη ανάλυση της αµπελοοινικής αλυσίδας: από την ίδια την ποικιλία, στη σύνθεση και δυναµική των µικροβιακών κοινοτήτων, έως την αξιολόγηση των επιµέρους µικροοργανισµών που φαίνεται να επηρεάζουνσηµαντικά την οινοποίηση και την ποιότητα των οίνων. Η επιλογή της αµπέλου βασίστηκε στην οικονοµική, πολιτιστική και βιοτεχνολογική της αξία, ενώ παρόµοιες µελέτες πραγµατοποιήθηκαν και σε άλλα είδη οικονοµικής σηµασίας, όπως ο λυκίσκος και βακτηριακά στελέχη µε προβιοτικό δυναµικό. Στο πλαίσιο αυτό, αναπτύχθηκε ένα πρακτικό και οικονοµικά βιώσιµο πρωτόκολλο γονοτύπησης ποικιλιών µέσω Μονονουκλεοτιδικών Πολυµορφισµών (SNPs) µε χρήση Αλληλούχησης Επόµενης Γενιάς (NGS), επιτρέποντας την πιστοποίηση της ποικιλίας, τη διαχείριση των αµπελώνων και τη διατήρηση της ελληνικής αµπελουργικής κληρονοµιάς. Η εφαρµογή του σε γηγενείς ελληνικές ποικιλίες αποκάλυψε σηµαντική γενετική ποικιλότητα και απουσία συνωνυµιών, διασφαλίζοντας την αυθεντικότητα του γενετικού υλικού και θέτοντας τις βάσεις για µελλοντικά προγράµµατα βελτίωσης. Επιπλέον, η ανάλυση του µικροβιώµατος καρπών της ποικιλίας Ασύρτικο έδειξε ότι τόσο η βιογεωγραφία όσο και η χρονιά συγκοµιδής επηρεάζουν τη σύνθεση των µικροβιακών κοινοτήτων, ενώ η παρακολούθηση των µικροβιακών κοινοτήτων σε αυθόρµητες οινοποιήσεις της ποικιλίας Sauvignon Blanc ανέδειξε τη μικροβιακή διαδοχή κατά τη ζύµωση και τον κύριο ρόλο των ζυµοµυκήτων, όπως ο Saccharomyces cerevisiae, καταδεικνύοντας την ανάγκη γονιδιωµατικού χαρακτηρισµού τους. Η Αλληλούχηση Ολόκληρου του Γονιδιώµατος (WGS) και η βιοπληροφορική ανάλυση του γηγενούς στελέχους Saccharomyces cerevisiae PasK102Sc, αποκάλυψε ότι πρόκειται για νέο, µη κατατεθειµένο στέλεχος µε σηµαντικό βιοµηχανικό δυναµικό, επιβεβαιώνοντας την αξία της χρήσης γηγενών ζυµών για τη διατήρηση του τοπικού χαρακτήρα των ελληνικών οίνων. Τέλος, η συγκριτική αξιολόγηση τριών µεταγονιδιωµατικών προσεγγίσεων για τον προσδιορισµό τωνµικροβιακών κοινοτήτων σε δείγµατα καρπών αµπέλου ανέδειξε την υπεροχή της τυφλής αλληλούχησης (shotgun) ως ολοκληρωµένης µεθόδου, προσφέροντας µεγαλύτερο αριθµό ταξινοµικών µονάδων, υψηλότερη ανάλυση σε γένος καιείδος και µικρό ποσοστό µη ταξινοµηµένων αλληλουχιών, σε σχέση µε τις µεθόδους αµπλικονίου (amplicon) και συναρµολόγησης (assembly). Συνολικά, παρά τους περιορισµούς της µελέτης, όπως η περιορισµένη γεωγραφική κάλυψη, η εργαστηριακή κλίµακα των πειραµατικών οινοποιήσεων και η έλλειψη µετα-µεταγραφωµικών/µεταβολοµικών δεδοµένων, η διατριβή παρέχει ένα µοντέλο που ενισχύει την ελληνική αµπελουργία και οινολογία, από το χωράφι έως το ράφι. Οι µελλοντικές προοπτικές αφορούν την περαιτέρω αξιοποίηση σύγχρονων τεχνικών Μοριακής Βιολογίας και περιλαµβάνουν την εφαρµογή των πρωτοκόλλων σε ευρύτερο φάσµα ποικιλιών και περιοχών, τη βιοµηχανική αξιολόγηση υποσχόµενων µικροοργανισµών και τη δηµιουργία εθνικής βάσης γενετικών δεδοµένων και υπογραφών µικροβιακού terroir, υποστηρίζοντας βιώσιµες και καινοτόµες πρακτικές στον ελληνικό αµπελοοινικό τοµέα.